細胞生物學實驗技術(shù)

1、第二章細胞生物學實驗技術(shù),本章內(nèi)容提要,第一節(jié) 顯微技術(shù) 一、光學顯微鏡 二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù) 第二節(jié) 生物化學與分子生物學技術(shù) 第三節(jié) 細胞分離技術(shù) 第四節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞雜交,第一節(jié) 顯微技術(shù),光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源,光學顯微鏡,1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng) 機械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成虛像,一）普通光學顯微鏡,3. 分辨力R：指分辨物體最小間隔的能力。 R=0.61/NA 為入射光線波長； 鏡口率 NA sin/2， n=介質(zhì)折射率； =鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 思考：如何提高顯微鏡的

2、分辨能力,幾種介質(zhì)的折射率,二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope,特點：光源為短波光，如藍光、紫外線等，激發(fā)產(chǎn)生熒光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡； 有兩個特殊的濾光片； 照明方式通常為落射式,分色鏡：反射和透射,屏障濾鏡：只允許特定波長的熒光通過以保護眼球及降低視野暗度,激發(fā)濾鏡：只通過對標本中熒光物質(zhì)合宜的激發(fā)光,Fluorescence image of epithelial(上皮) cell, DNA in blue and Microtubules in green,用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷,三）激光共聚焦掃描顯微

3、境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus（非洲爪蟾 ） Melanophore（載黑素細胞） microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue,激光共聚焦掃描 顯微鏡光路圖,四）暗視野顯微鏡 dark field

4、 microscope,丁達爾現(xiàn)象 聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子,普通光學顯微鏡看不見未染色的組織、細胞和細菌、病毒等活機體的圖像，因為通過樣品的光線變化差別（反差）很小。 標本染色后改變了振幅（亮度）和波長（顏色），影響了反差而獲得圖像。但是染色會引起樣品變形，也可使有生命的機體死亡。要觀察不染色的新鮮組織、細胞或其他微小活體必須使用位相顯微鏡。 在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之

5、間。 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4,五）相差顯微鏡,相位板上的環(huán)形光闌,相位檢測環(huán),用途：觀察未經(jīng)染色的玻片活體標本,六）微分干涉差顯微鏡 Differential interference contrast microscope （DIC,1952年，法國物理學家諾曼爾斯基(G.Nomarski)發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。 起偏鏡片 檢偏鏡片 標本略厚一點，折射率差別更大，影像的立體感更強,七）倒置顯微鏡 inverse microscope,物鏡與照明系統(tǒng)

6、顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置,八）當代顯微鏡的發(fā)展趨勢,采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。 自動化與電子化,二、電子顯微鏡,一）透射電子顯微鏡 transmission electron microscope, TEM,以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），

7、即小于0.2m、光學顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures,1. 原理,透射電子顯微鏡,TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM,不同光線的波長,2、制樣技術(shù),1）超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色,2）冰凍蝕刻 freeze-etching,亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴

8、露出了斷面結(jié)構(gòu)。 向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica,A Yeast Cell,20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結(jié)構(gòu)。 分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X,二）掃描電子顯微鏡,Scanning electron microscope（ SEM,工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同

9、步的掃描圖像。 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號,掃描電子顯微鏡原理,人類紅細胞,酵母,人類精子,三、顯微操作技術(shù)micromanipulation technique,在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。 顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。 顯微操作技術(shù)包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等,顯微操作儀,第二節(jié) 生物化學與分子生物學技術(shù),一、細胞化學技術(shù),組織化學和細胞化學染色方法（histochemical and cytochemical

10、 staining method）用于對某些細胞成分進行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。 化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定,二）顯示方法,金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。 Schiff反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。 聯(lián)苯胺反應：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。 脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類

11、而使脂類顯色。 茚三酮反應：顯示蛋白質(zhì),二、免疫細胞化學 immunocytochemistry,根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。常用的標記物有熒光素和酶。 免疫熒光法（immunofluorescent technique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位,三、放射自顯影術(shù),用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。 原理：將放

12、射性同位素標記的化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。 14C半衰期為5730年，3H為12.5年,四、分子雜交技術(shù),具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。 （一）原位雜交（in situ hybridization）。 將標記的核酸探針與細胞或組織中的

13、核酸進行雜交。 使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置,二）Southern雜交,是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。 將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交,六、PCR 技術(shù),PCR即：polymerase chain reaction。 反應體系：樣品DNA；引物（primer），約15-20個核苷酸；4種dNTP；Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermus

14、aquaticus，最適作用溫度7580，短時間在95下不失活。緩沖體系和Mg2+。 反應過程：變性：約90-95；復性：約60左右；延伸：70-75；重復 “變性復性延伸” 過程20-30次循環(huán),PCR原理,第三節(jié) 細胞分離技術(shù),一、離心技術(shù),是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速為1025kr/min的離心機稱為高速離心機。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89K者稱為超速離心機。 目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg,一）差速離心 Differential centrifugation,特點： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，

15、逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化,Low speed,High speed,Differential centrifugation,二）密度梯度離心,用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）

16、對細胞無毒,1、速度沉降 velocity sedimentation,用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離,2.等密度沉降 isopycnic sedimentation,用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度。 所需的力場通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，

17、從而將不同密度的成分分離,Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation,分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器,分離密度不等的顆粒,介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度,介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度,二、流式細胞術(shù),用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。 原理： 包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴； 在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。 包被細胞的液流稱為鞘液，所用

18、儀器稱為流式細胞計（flow cytometer,第四節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞雜交,一、細胞培養(yǎng),一）動物細胞培養(yǎng),群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；（細胞類型不同） 克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（細胞類型相同,原代培養(yǎng) （primary culture）：培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。 細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系(cell line)。 細胞株（cell strain）：從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系由單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細胞增殖形成的細胞群稱細胞株(cell strain)。 細胞系先有，然后經(jīng)過選擇培養(yǎng)才有細胞株 克?。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群,表三、實驗室中常