實驗2.特殊顯微鏡及其使用.ppt

1、實驗2 特殊顯微鏡及其使用,暗視野顯微鏡 相差顯微鏡,一、實驗?zāi)康?1.學習暗視野顯微鏡的原理、了解其構(gòu)造 2.練習暗視野顯微鏡的使用,二 暗視野顯微鏡的原理及構(gòu)造,根據(jù)丁達爾效應(yīng)原理設(shè)計的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡 觀察到明場看不到的極其微小的物體 最高分辨率可達0.004微米,2.1 原理 丁達爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內(nèi)飛揚的微?；覊m是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒?？梢娏?，這就是微粒發(fā)光。 暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設(shè)計的。 2.2 結(jié)構(gòu)特點 使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地

2、通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個視野是黑暗的,暗視野顯微鏡原理,2.3 成像特點及優(yōu)缺點 在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在和運動，不能辨清物體的細微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時，并大于12波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。 一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)微粒的運動等,2.4 應(yīng)用：微小粒子、

3、細菌形態(tài)、細菌記數(shù)，透明標本觀察等。 2.5 暗場顯微鏡的要求 要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵 物鏡前透鏡必須清潔無塵 載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求,1.6 暗場觀察方式調(diào)節(jié) (1)換上暗場聚光鏡。 (2)將視場光闌適當縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時在視場中看到視場光圈的輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡，使視場光圈像清晰可見。 (3)視場光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側(cè)兩個調(diào)節(jié)螺絲進行調(diào)整，再將其開大到相應(yīng)位置,自己動手制作暗視野顯微鏡,暗視野光擋 (左：金屬片或厚卡紙制成; 右：透明濾色鏡貼黑紙制成,三、實驗用品,1.材料：口腔黏膜上皮細胞、洋蔥內(nèi)表皮細胞 2.試劑：生理鹽水、

4、蒸餾水 3.器材和儀器：載玻片、蓋玻片、顯微鏡、擦鏡紙等,四、實驗內(nèi)容,1、口腔黏膜上皮細胞和洋蔥內(nèi)表皮細胞裝片制作 2、用暗視野顯微鏡觀察樣品,五、作 業(yè),繪制暗視野內(nèi)的口腔黏膜上皮細胞和洋蔥內(nèi)表皮細胞圖（3-5個細胞,二）相差顯微鏡,相差顯微鏡（phasecontrast microscope）由荷蘭物理學家澤爾尼克(Frits Zernike ,1898-1966),于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎,一、實驗?zāi)康?1.學習相差顯微鏡的原理、了解其構(gòu)造 2.練習相差顯微鏡的使用,二 實驗原理,光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不

5、同。 當光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本的道理。而活細胞和未經(jīng)染色的生物標本，因細胞各部微細結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應(yīng)發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到,相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。 結(jié)構(gòu)特點 相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡代替

6、普通物鏡，并帶有一個合軸調(diào)節(jié)用的望遠鏡。 環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的,相差顯微鏡的特殊構(gòu)造與光路,相差顯微鏡的特殊構(gòu)造與光路,相差顯微鏡的光路,相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。 調(diào)軸望遠鏡是用來進行合鈾調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合（共軛重合），才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應(yīng)被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就

7、失去了相差顯微鏡的作用,使用方法 （1）相差裝置的調(diào)換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 （2）調(diào)焦 打開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“0”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調(diào)焦。 旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)，如相差物鏡為40X時應(yīng)用40X標示孔的光闌,3）合鈾調(diào)整 拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動望遠鏡內(nèi)筒使其上升，當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。 （4）觀察 換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌,用途 用于觀察組織培養(yǎng)中活細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)?；罴毎麩o色透明，一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結(jié)構(gòu)，組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡,三、實驗用品,1.材料：口腔黏膜上皮細胞、洋蔥內(nèi)表皮細胞 2.試劑：生理