水產品中孔雀石綠殘留量的測定-楊洪生PPT優(yōu)秀課件

1、1,水產品中孔雀石綠殘留量的測定,楊洪生 江蘇省水產質量檢測中心 農業(yè)部漁業(yè)產品質量監(jiān)督檢驗測試中心（南京）,2,目 錄,3,1. 簡 介,4,孔雀石綠,中文名稱：孔雀石綠、堿性綠、嚴基塊綠、孔雀綠 英文名稱：malachite green , MG CAS No. ：2437-29-8(oxalate salt) ；569-64-2(chloride salt) 分 子 量 ：929.0 (oxalate salt)；364.9 (chloride salt) 金屬光澤的綠色結晶 易溶于水，溶液呈藍綠色；溶于甲醇、乙醇和戊醇 見光易分解,孔雀石：Cu2(CO3)(OH)2 僅僅顏色相近,5,

2、鹽酸鹽,草酸鹽,孔雀石綠結構式,6,無色孔雀石綠,英文名稱： leucomalachite green, LMG CAS No. ： 129-73-7 分 子 量 ： 330.5 不溶于水，但易溶于乙腈、二氯甲烷等 LMG比MG更加穩(wěn)定； 在體內殘留的主要形態(tài),無色孔雀石綠,7,8,孔雀石綠的危害,高殘留,高致癌,孔雀石綠及其代謝產物無色孔雀石綠能迅速在組織中蓄積，如已在受精卵和魚苗的血清、肝、腎、肌肉和其他組織中檢測到。 無色孔雀石綠由于其不溶于水，殘留毒性比孔雀石綠更強。,孔雀石綠分子中與苯基相連的甲基受苯環(huán)影響，有較高的反應活性，可生成自由基三苯甲基；此外孔雀石綠也能抑制人類谷光甘肽S轉

3、移酶的活性。 此兩者均能造成人類器官組織細胞的異常，誘發(fā)腫瘤和脂質過氧化。,9,高致畸,致突變,當孔雀石綠濃度低于0.1mg/mL時，它仍能使兔和魚繁殖致畸；當孔雀石綠濃度高于0.2 mg/L時，軟體動物（東風螺）的受精卵或是幼體都有不同程度的發(fā)育畸形。,研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠可使鳙魚和尼羅羅非魚的紅細胞產生微核，且微核率隨藥物濃度的升高而增加。,10,研究發(fā)現(xiàn)MG與LMG均能使大鼠肝細胞空泡化，無色孔雀石綠還能使甲狀腺濾泡上皮大量凋亡，減少公鼠甲狀腺激素的釋放； 能抑制血漿膽堿脂酶的作用，進而有可能造成乙酰膽堿的蓄積而出現(xiàn)神經癥狀。 此外，它還能通過溶解足夠的鋅，引起水生動物急性鋅中毒，并引起魚類

4、消化道、鰓和皮膚輕度發(fā)炎，從而影響魚類的正常攝食和生長，能阻礙腸道酶（如胰蛋白酶、a-淀粉酶）的活性，影響動物的消化吸收功能。,高毒性,11,目前禁用孔雀石綠的主要國家和地區(qū),加拿大于1992年禁止其作為漁場殺菌劑 美國規(guī)定在食用水產品中禁止檢出 歐盟于2002年6月頒布法令禁止在漁場中使用 日本禁止在水產品中檢出孔雀石綠,12,2005年，英國一家知名的超市連鎖店出售的有機鮭魚體內被發(fā)現(xiàn)含孔雀石綠，隨即在全球引發(fā)“圍剿”孔雀石綠的活動。 同年8月，韓國在福建、江西和安徽等地的出口鰻魚產品中檢出含有孔雀石綠。 數日后在香港市場出售的多種淡水魚中檢出含有孔雀石綠。 對我國的水產品出口貿易造成了不

5、可挽回的經濟損失。,13,中國孔雀石綠監(jiān)控歷程,2000年度中華人民共和國出口動物及動物源性食品中有毒有害物質殘留監(jiān)控計劃 首次將出口鰻魚中孔雀石綠殘留量的監(jiān)控列入年度計劃 無公害食品水產品中漁藥殘留限量（NY 5070-2001） 孔雀石綠規(guī)定為“不得檢出” 食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單農業(yè)部農牧發(fā)20021號 孔雀石綠為禁用藥物 2004年度中華人民共和國出口動物及動物源性食品有毒有害物質監(jiān)控計劃 將養(yǎng)殖蝦和鰻魚中孔雀石綠的限量要求規(guī)定為“不得檢出”,14,孔雀石綠常用檢測方法,15,孔雀石綠屢禁不止的原因,價廉易得 對水霉病等療效好，缺少替代藥 缺乏有力的監(jiān)管 養(yǎng)殖者對孔雀石綠副作

6、用了解不深,16,2.樣品前處理,17,水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定 （GB/T 19857-2005),18,儀器與設備,1100液相色譜儀（DAD二極管陣列檢測器）（美國Agilent公司）； 酸性氧化鋁柱，1g/3mL（美國Supelco公司）； 固相萃取裝置（美國Supelco公司）； XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）； AllegraTM 21R臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）； R-205Avanec旋轉蒸發(fā)儀（德國Buchi公司）； 0.22m濾膜（江蘇漢邦科技有限公司）。,19,藥品與試劑,乙腈、二氯甲烷、冰乙酸 （色譜純，Tedia公司）；

7、 孔雀石綠標準品、隱色孔雀石綠標準品（美國Sigma公司）； 無水乙酸鈉（南京化學試劑一廠）； 對甲苯磺酸（上海凌峰化學試劑有限公司）； 鹽酸羥胺（南京化學試劑有限公司）； 二甘醇（Fluka公司）； 酸性氧化鋁，100-200目（國藥集團化學試劑有限公司）； Millipore 超純水。,20,樣品準備,實驗中所采用的樣品為魚樣，去鱗、去皮，沿背脊取肌肉，用高速萬能試樣粉碎機打成勻漿，冷凍保存，用前解凍。,21,樣品稱取,稱取5.00 g樣品于50 mL離心管內,22,提取,加入： 1.5 mL 20%的鹽酸羥胺溶液 2.5 mL 1.0 mol/L的對-甲苯磺酸溶液 5.0 mL pH4.

8、5 乙酸鹽緩沖溶液， 渦旋混合3min； 加入10 mL乙腈劇烈混合3min。,23,在國家標準中，渦旋混合的時間為30s； 但從實際出發(fā)，渦旋混合時間長一些有助于提取液從肉樣中充分提取出目標物； 在實際處理過程中建議在3min以上。,24,加入5g酸性氧化鋁 再次混合3min,25,提取孔雀石綠時酸性氧化鋁的加入量由樣品所含的雜質量決定。如蟹黃等雜質較多的肉樣可多加一些，鱈魚、青蝦等可少加一些，不一定要求為5g。,26,10 000 r/min離心15 min 上清液轉移至100 mL離心管中 預先裝有10 mL 水和2 mL 二甘醇,27,在50 mL離心管中加入10 mL乙腈，重復上述操

9、作，合并乙腈層。,28,在100 mL離心管中加入 15 mL 二氯甲烷 混合2min 4 000 r/min離心10 min，,29,將二氯甲烷層轉移至100 mL的棕色圓底燒瓶中 再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重復上述操作一次，合并二氯甲烷層于100 mL棕色圓底燒瓶中。,30,35旋轉蒸發(fā)至約1 mL，用2.5 mL乙腈溶解殘渣 將酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，用5mL乙腈活化柱子。 將圓底燒瓶中的溶液轉移到柱上，再用乙腈洗滌瓶兩次，每次2.5 mL, 再用5mL乙腈沖洗柱子，把洗滌液依次通過柱，控制流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液。,31,如果試樣雜質較少，本身

10、比較潔凈，如鱈魚、青蝦等，是否可以跳過過柱這一步，直接將二氯甲烷提取液旋轉蒸發(fā)干以簡化前處理？ 對此作了8個樣品加標試驗，每個樣品各加 0.05gmL-1標樣1mL，前4個不過柱，后4個過柱。 實驗結果表明：過酸性氧化鋁柱是必需的，它對無色孔雀石綠的回收率沒什么影響，卻有效的挽回了孔雀石綠回收率的損失。而且，除去大量雜質，使樣品譜圖更干凈、美觀。,32,35旋轉蒸發(fā)至干 準確用1.0mL乙腈溶解 過0.22m有機相濾膜，濾液供液相色譜測定,33,3.樣品檢測,34,液相色譜檢測條件,色譜柱：C18柱，250mm4.6mm(i.d.)，5m，在C18色譜柱和檢測器之間連接 25%PbO2氧化柱；

11、 流動相：乙腈和乙酸銨緩沖溶液(pH 4.5)(體積比為80：20)； 檢測波長：618 nm； 柱溫：35； 進樣量：20L； 流速：1.0 mL/min。,35,研究了不同配比的乙腈和乙酸銨緩沖液的流動相體系，發(fā)現(xiàn)當增加乙腈或水的比例，會改變MG和LMG的保留時間，甚至會出現(xiàn)LMG比MG提前出峰。 但由于每次配制的流動相存在差異，因此使得MG和LMG的保留時間在每批次分析中存在一定的差異，但在同一批次的分析過程中，MG和LMG的保留時間基本保持穩(wěn)定，能夠達到達基線分離，峰形尖銳、對稱。,36,4.結 果,37,標準物質色譜圖,0.10g/mL標準品色譜圖,38,樣品空白色譜圖,樣品空白色譜圖,39,樣品加標色譜圖,4.0g/kg加標樣品色譜圖,40,標準曲線,回歸方程與相關系數,41,最低檢測限（MDL）,MDL計算公式：MDL=3CN/R 式中：MDL為最低檢測限 C為最低加標樣品， N為實測噪聲， R為檢測器（DAD）響應值，采用峰面積。 2.0g/kg加標樣品，測得MG和LMG的R/N分別為6.2、8.5 按上式計算得本方法MDL：MG為1.0g/kg、LMG為0.7g/kg。,42,MG回收率與精密度（n=6）,43,LMG回收率與精密度（n=6）,44,雙人比對考核,兩名檢測人員參加加標考核