9 快速檢驗.ppt

1、第九章 快速檢驗,第九章 快速檢驗,第一節(jié) 酶法 第二節(jié) 免疫法 第三節(jié) 核酸雜交法 第四節(jié) PCR法 第五節(jié) 實時熒光定量PCR 第六節(jié) rRNA及rRNA區(qū)間序列用于快速檢驗,第一節(jié) 酶法,一、腸球菌的檢驗 二、溶血性鏈球菌的檢驗 三、大腸菌群和大腸桿菌的檢驗 四、沙門氏菌的檢驗 五、志賀氏菌的檢驗 六、李斯特菌的檢驗 七、產氣莢膜梭菌的檢驗 八、副溶血性弧菌的檢驗,第一節(jié) 酶法,許多微生物能產生特異性的酶，雖然是特有，但有一部分微生物可能具有相同的酶，這樣即可將這群微生物與其他微生物區(qū)別開來，可用于初篩。 一般利用特異性酶的底物與顯色物質或產生熒光的物質結合。當遇到產生有關酶的微生物時，

2、顯色物質或產熒光物質被釋放出來，通過肉眼直接觀察或在紫外燈下觀察，判斷結果。 盡管這種方法不能百分之百地準確，有少數變異菌株屬例外，但大多數情況下能滿足快速檢驗的要求?？杀苊膺M一步培養(yǎng)和生化鑒定。 常用的方法如下： 色原（熒光）糖苷結合物+糖苷酶糖苷+色原（熒光） 色原（熒光）氨基酸結合物+氨肽酶氨基酸+色原（熒光） 酶法檢測常使用的底物如表。,表9-1酶法檢測常使用的底物及應用,常用的呈色色原和熒光物質,常用的呈色色原有： -萘酚、-萘酚、鄰硝基酚、對硝基酚、對硝基苯胺、酚酞、2-氨-4-硝基苯、吲哚基系列物質等。 常用的熒光物質：有4-甲基傘形酮（4-甲基-傘形基- -D-葡萄糖醛酸苷，4

3、-MUG），,一、腸球菌的檢驗,在腸球菌的檢驗中初篩選使用焦骨?；彪拿福ㄟ量┩榛减０访?，PYR）、亮氨酸氨肽酶（LAP）。大多數腸球菌二者皆陽性。利用此二酶可區(qū)分-溶血性鏈球菌、明串珠菌、魏斯氏菌（Weissella,原屬明串珠菌的一部分）和片球菌。個別腸球菌（如解腸球菌、盲腸腸球菌和鴿腸球菌）為PYR陰性。某些鏈球菌（釀膿鏈球菌和類似于腸球菌的個別菌株）為PYR陽性，但其他鏈球菌為陰性。片球菌為PYR陽性、LAP陰性。明串珠菌為PYR陰性、LAP陰性。使用的底物有L-焦谷氨酸-7-氨基-甲基香豆素、 L-亮氨酸-7-氨基-甲基香豆素、 L-亮氨酸-7-氨基-甲基香豆素鹽酸。 除使用以上兩

4、種酶外，腸球菌檢測中還經常使用的酶是。使用的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖吡喃糖苷。分解后產生藍色菌落。釀膿鏈球菌不產生此酶，而產生此酶的菌都被疊氮化鈉抑制。經試驗明串珠菌、乳酸乳球菌乳亞種、氣球菌屬的有些種也產此酶。,二、溶血性鏈球菌的檢驗,在溶血性鏈球菌的檢驗中也使用吡咯烷基芳酰胺酶。釀膿鏈球菌、腸球菌、氣球菌此酶陽性。使用底物為L-吡咯烷基- -萘酰胺，在酶作用下，放出-萘胺。 -萘胺與N,N-二甲基肉桂醛作用變成深紅色。已有檢驗用試紙條產品。 98%的A群鏈球菌、96%的腸球菌分解L-吡咯烷基- -萘酰胺。 98%的AB群鏈球菌，100% A、B、D群以外的鏈球菌，82%的

5、草綠色鏈球菌， 100% D群外的腸球菌吡咯烷基芳酰胺酶陰性。其他吡咯烷基芳酰胺酶陽性的有葡萄球菌、肺炎鏈球菌。,三、大腸菌群和大腸桿菌的檢驗,近年來大腸菌群和大腸桿菌的檢驗中已廣泛應用-D-半乳糖苷酶和-D-葡糖醛酸苷酶。在大腸菌群檢驗中檢測-D-半乳糖苷酶。該酶看將乳糖分解，底物一般使用5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖吡喃糖苷。該物質被分解后變成藍綠色，指示大腸菌群存在。大腸菌群產生的-D-半乳糖苷酶也可用以下底物檢測：鄰硝基酚- -D-吡喃半乳糖苷酶（ONPG)，6-氯-3-吲哚氧基-吡喃半乳糖苷， 5-溴-6-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷，8-羥喹啉- -D-半乳糖苷，4-甲基傘

6、形酮基-D-吡喃半乳糖苷， N-甲基吲哚基-D-吡喃半乳糖苷， 6-溴-2-萘-D-吡喃半乳糖苷。 在大腸桿菌檢驗中檢測-D-葡糖醛酸苷酶。該酶催化-D-吡喃葡糖醛酸與色基結合物水解成相應的苷配基和-D-葡糖醛酸。但EHEC(如O157:H7)不具此酶。有用4-甲基傘形酮基-D-葡糖醛酸苷為底物的。該化合物經酶作用產生4-甲基傘形酮和葡糖醛酸。 4-甲基傘形酮在366nm下產生藍色熒光。,四、沙門氏菌的檢驗,在沙門氏菌檢驗中使用辛酸酯酶。一般使用4-甲基傘形酮-辛酸酯或-萘酚辛酸酯為底物。辛酸酯酶將以上底物分解產生4-甲基傘形酮或-萘酚。4-甲基傘形酮在366nm下產生藍色熒光。-萘酚與固藍反

7、應產生紅色或紫紅色物質。該反應紙片上完成，5min出結果。此法由王金良等首創(chuàng)。使用的其他底物有5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-辛酸酯和X-辛酸（5-溴-4-氯-3-吲哚基辛酸） 福氏志賀氏菌、產氣腸桿菌、普通變形桿菌、摩根氏菌、不動桿菌等。辛酸酯陽性的還有個別大腸桿菌、黏質沙雷氏菌、銅綠假單胞菌等假單胞菌、氣單胞菌和鄰單胞菌。 有的沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基中（ABC瓊脂）測定-D-半乳糖苷酶和-D-半乳糖苷酶。使用的底物是3，4-環(huán)己烷（烯）七葉亭-D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷酶（X-gal）。前一底物在-D-半乳糖苷酶作用下分解，產生遇鐵變黑的物質。后一種底物在-D-半

8、乳糖苷酶作用下產生綠色物質。一般的沙門氏菌中傷寒沙門氏菌及甲型副傷寒沙門氏菌和乙型副傷寒沙門氏菌具有-D-半乳糖苷酶，而缺乏-D-半乳糖苷酶。但發(fā)酵乳糖的沙門氏菌，因具有-D-半乳糖苷酶顯示為黑色菌落，不能檢出。,第二節(jié) 免疫法,一、熒光抗體法 二、免疫磁珠技術 三、免疫酶技術 四、免疫層析技術,抗原抗體反應的種類,凝集反應：直接凝集反應（玻片法、試管法）、間接凝集反應 沉淀反應 補體結合反應 免疫熒光反應：直接法、間接法、補體法,免疫學檢測技術,是利用抗原抗體反應進行的檢測方法，即應用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測標本中的相應抗體或抗原。它的特點是具有高度的特異性和敏感性。 免疫技

9、術在食品污染細菌及其毒素檢測、污染真菌及其毒素檢測、食品抗生素檢測，農藥殘留檢測和食品摻假識別等食品安全檢測和分析中都得到了應用。,免疫標記技術,將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進行標記，則在與標本中的相應抗體或抗原反應后，可以不必測定抗原抗體復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標記物的放大作用，進一步提高了免疫技術的敏感性。,經典的三大標記技術,熒光抗體技術、放射免疫分析和酶免疫技術 1941年Coons建立的熒光抗體技術（fluorescent antibody technique）。 1956年Yalow和Berson建立的放射免疫測定（ra

10、dio immunoassay，RIA）。 1966年Nakene和Pierce利用酶使底物顯色的作用而得到與熒光抗體技術相似的結果。70年代初，酶標抗體技術開始應用于免疫測定，其后得到迅速發(fā)展。,一、熒光抗體法,用熒光物質標記抗血清或標記抗血清的抗體，即抗抗體。使用熒光顯微鏡觀察樣品中的目的菌-熒光標記抗體結合物或目的菌-抗體-熒光標記抗體結合物來判斷結果。先將熒光物質標記在抗體或抗抗體上，通過免疫反應檢測抗原（或抗原-抗體結合物），如果二者對應結合，形成帶有熒光物質的免疫復合物不被水洗掉，在熒光顯微鏡下可見熒光。如果二者不反應，不形成免疫復合物，熒光物質將被水沖洗掉，在熒光顯微鏡下不顯熒光

11、。 常用熒光素有異硫氰酸酯和羅丹明，可與抗體蛋白中的賴氨酸氨基結合。異硫氰酸酯（最大吸收波長為490-495nm，最大熒光波長為520-530nm）和羅丹明（最大吸收波長為550nm，最大熒光波長為620nm）在藍紫光下分別呈黃綠色和玫瑰紅色。 實際上此法常與熒光標記酶技術結合使用。用4-甲基傘形酮標記有關酶，最終測4-甲基傘形酮發(fā)出的熒光。,二、免疫磁珠技術,用連接抗體的磁珠捕捉增菌液中的目的菌，然后將捕捉到的抗原即目的菌劃線于選擇性平板，觀察菌落?；蛴脽晒饣蛎笜擞浀目箍贵w進行檢測。或用聚合酶鏈式反應技術進行進一步檢測。此技術代替了常規(guī)的選擇性增菌過程，正越來越受到青睞。,三、免疫酶技術,以

12、酶標記抗體或抗抗體，抗原與酶標記抗體，或抗原-抗體結合物與酶標記抗抗體特異性結合。酶對底物具有高效催化作用，酶反應時底物又有顏色變化。酶與抗體或抗抗體結合，即不改變抗體或抗原的免疫反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性。根據有色產物的有無及其濃度，即可間接推測被檢抗原或抗體是否存在及其數量。 常用聚苯乙烯微量反應管吸附抗原或抗體，使其固相化，然后在其中進行免疫反應和酶促反應。通過檢查酶促反應的結果進行判斷。如先將抗體固定于酶標板的微孔內席芳目的菌后，洗去沒有反應的物質。用酶連抗抗體進行反應，在洗去沒有反應的物質。加入酶底物反應后測吸光值。 常用的酶有辣根過氧化物酶與磷酸酶類。,酶聯(lián)免疫吸附測定

13、,ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）用于IgG定量測定的文章。 專一性檢測微量樣品（109克）。專一性強，靈敏度高。,基本原理：,以96孔、48孔或40孔的聚丙乙烯塑料微孔板又稱為酶標板為載體. 在適當的條件下使抗原或抗體包被（吸附）在酶標板微孔的內壁上成為所謂的包被（固相）抗原或抗體，沒有被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去。 然后直接加入酶標記抗體或抗原形成酶標記的抗原抗體復合物固定在微孔中，沒有吸附的酶標記物洗滌去除。,加入酶底物溶液于微孔中，復合物上的酶催

14、化底物使其水解、氧化或還原成為有色的產物。 在一定條件下，復合物上酶的量（也反應了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產物呈現的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定。 由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。,幾種ELISA,ELISA 可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。 1、直接法：是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結合形成酶標抗原抗體復合物，加入酶反應底物，測定產物的吸光值，計算出包被在酶標板上的抗體或抗原的量。,2、間接法（Indirect ELISA）,將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結合形成復合后，再以酶標

15、二抗和復合物結合，通過測定酶反應產物的顏色可以反映一抗和抗原的結合情況，進而計算出抗原或抗體的量。,3、夾心法（Sandwich ELISA）,直接夾心法：先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與之反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物； 間接夾心法：象間接法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原-抗體復合物結合形成抗體-抗原-抗體-酶標二抗復合物,4.競爭法ELISA,在抗原抗體反應過程有競爭現象的存在。 首先將包被了抗體的酶標板的微孔分為測定孔和對照孔，在測定孔中同時加入酶標抗原和非酶標抗原（待測樣品）。 標記抗原和非標記抗原相互競爭包被抗體的結合點，沒有結合到包被抗體上的標記抗原

16、和非標記抗原通過洗滌去除。,如果非標記抗原濃度越高，則結合到包被抗體上的量就越多，而酶標記抗原結合在包被抗體上的量就越少，反之，相反。 對照孔中不加入非標記抗原，只加標記抗原。 這樣對照孔中結合的酶標記抗原的量最多，酶反應產物的顏色越深，而測定孔中顏色的深淺則反映了非標記抗原（待測物）的濃度。,5.應用親和素和生物素的ELISA,親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合?，F在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。 生物素（biotin）又稱維生素E，分子量244.31，存在于蛋黃中。 親和素與生物素的結合，特異性

17、強，親和力大，兩者一經結合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大大提高ELISA的敏感度。,橋連法ABC-ELISA夾心法測抗原示意圖,酶聯(lián)免疫法檢測沙門氏菌,增菌（SC,TTB),前增菌（樣品+乳糖肉湯）,后增菌（甘露醇肉湯）,釋放抗原（水浴鍋煮沸20min，冷5min),菌體抗原與抗體反應（效價皿孔中加100l增菌液）,洗去多余抗體（6倍洗液）,加抗抗體-酶復合體（加100l）,洗去多余抗抗體（6倍洗液）,加酶反應底物,加終止液，測吸光值,35，24h,35，24h,35

18、，24h,35，30min,35，30min,由于抗原的變異及沙門氏菌與其他腸道桿菌有交叉反應，假陽性大量出現，此法一般用于大規(guī)模排除不含沙門氏菌的食品檢樣。如果是陽性結果，還需要常規(guī)法完成檢驗。免疫法多用于快速篩選含目的菌的樣品，進行初步鑒定。,四、免疫層析（也叫金標免疫）技術,該技術是一種膜固相免疫測定技術。滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用向另一端移動，猶如層析一般。移動過程中被分析物與固定于膜上某一區(qū)域的抗原或抗體結合而被固相化，無關物質則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標記物的顯色來判定實驗結果。以膠體金為標記物的實驗稱為膠體金免疫層析技術。有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點。 膠體金

19、也稱金溶膠，是指由直徑為1100nm范圍內的金顆粒所組成的分散體系。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構成，緊連在金核表面的是內層負離子（AuCl2-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。,膠體金的原理,氯金酸（HAuCl2-）在還原劑（常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等）作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。 膠體金標記，實際上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面帶負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附

20、而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和食品微生物檢驗中成為非常有用的工具。 實驗膠體金免疫層析技術檢驗致病菌時膠體金用于標記目的菌的抗體，因具有金的紅色而被識別。 膠體金呈什么顏色由膠體金粒子的大小決定。最小的膠體金（25nm）是橙黃色的；膠體金顆粒在520nm之間，吸收波長為520nm，呈葡萄酒紅色；顆粒在20 40nm之間的吸收波長為530nm；液體為深紅色，60nm的膠體金溶液主要吸收

21、波長為600nm，溶液呈藍紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。 由于使用非?？旖莘奖?，此項技術有普及化的趨勢。,金標免疫技術,是以膠體金作為標記物。這一技術在70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術。 膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。 膠體金的制備： 多采用還原法。氯金酸（HAuC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。,膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。 用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質（抗原或抗

22、體）結合，這類膠體金結合物常稱為免疫金復合物，或簡稱免疫金（immunogold）。,gold-labeled immunosorbent assay(GLISA),Three easy steps: 1. Add media, sample and incubate,Three easy steps: 2. Transfer 150ul enriched sample to one device,One line = Negative,Two lines = Positive,Three easy steps: 3. Wait 10 min and read result.,以雙抗夾心法測沙

23、門氏菌,試板中A處為膠體金標記的沙門氏菌抗體，硝酸纖維素膜是T處包被抗抗體，C處包被抗小鼠IgG抗體。 測試時在A端加入目的菌增菌液后的水煮液，形成沙門氏菌-金標記沙門氏菌抗體復合物。通過層析移行至T區(qū)，形成沙門氏菌-金標記沙門氏菌抗體-抗抗體復合物，在T區(qū)顯示紅色線條，為陽性反應。多余的沙門氏菌-金標記沙門氏菌抗體復合物移行至C區(qū)時被抗小鼠IgG抗體捕獲，而顯示出紅色對照線條。如樣品中不含沙門氏菌，在T區(qū)不出現紅色線條，僅在C區(qū)出現紅色線條，實驗結果為陰性。如C區(qū)無紅色線條出現，表示實驗無效。因此T區(qū)為測試區(qū)，C區(qū)為對照。,A,T帶,C帶,B,吸水墊,非特異性抗體,抗抗體,點樣孔,含膠體金標

24、記的特異性抗體,免疫層析技術檢測沙門氏菌,增菌（RVS增菌液),前增菌（樣品+緩沖蛋白胨水）,水浴鍋煮沸釋放抗原,觀察結果，如果是陰性，報告結果為陰性，如果是陽性時劃線于選擇性平板,挑取菌落進行生化測定,出結果,35，1820h,42，24h,15min,36，24h,取150 l煮沸液滴入樣品孔中,20min,第三節(jié) 核酸雜交法,雜交法可分為固相雜交和液相雜交。最常用的是黏棒式雜交法（一種液相雜交法）。雜交法一般需要105106拷貝的靶基因。雜交時首先提取模板核酸。然后通過有特定核苷酸序列的探針與模板雜交，確認模板中有無特定的核苷酸序列。如果有時可以判定有目的菌存在。探針是指能與某種大分子發(fā)

25、送特異性相互作用，并在相互作用之后可以檢測出來的生物大分子。核酸探針是指能識別特異堿基順序的帶有標記的一段DNA或RNA分子，有特定的核苷酸序列。探針使用特異性的基因DNA或rRNA。 的優(yōu)點是數目多，比mRNA更具有保守性。 常使用的標記法有堿性磷酸酯酶、標記法、生物素標記法、熒光標記法和放射性標記法。酶法標記時，酶與探針以化學鍵相連。當底物存在時發(fā)生反應產生顏色變化。生物素標記法中利用生物素與酶標記的抗生物素蛋白特異性結合，再用酶反應顯色來測定。熒光標記利用熒光素與辣根過氧化物酶標記的抗熒光素特異性結合，再用酶反應顯色來測定。 主要方法有：一、雜交法1：黏棒式雜交法（測桿技術） 二、濾紙或

26、濾膜雜交法（一種固相雜交法）,核酸分子雜交,根據互補的核苷酸序列以堿基配對形成穩(wěn)定的雙鏈分子的原理。 依據堿基互補配對的原則，以已知的DNA或RNA片段來檢測未知的DNA或RNA片段。 已知的DNA或RNA片段稱為探針（probe）。 未知的DNA或RNA片段稱為探針的靶（target)。,核酸的雜交,一、雜交法1：黏棒式雜交法（測桿技術）,增菌（SC,TTB）,前增菌（樣品+乳糖肉湯）,后增菌（甘露醇肉湯）,細胞裂解（廠家提供方法）,雜交(加探針溶液到裂解液中。65 水浴。管中加已洗好的黏棒）,水洗黏棒（ 65 水洗液）,探針與酶結合體反應（移黏棒至酶結合體管）,酶與底物反應（移黏棒至底物-

27、色源管）,測試反應產物（加終止液，測吸光率）,35，24h,35，24h,35，24h,65水浴保持60min,20min,水洗黏棒,20min后去掉黏棒,數據處理及記錄,二、濾紙或濾膜雜交法（一種固相雜交法）,先把平板上的菌落印到硝化纖維素濾紙上。使用真空過濾法把樣品固定在硝化纖維素濾紙上；用堿液破壞樣品細菌的細胞壁以釋放出DNA或RNA；添加乙醇使釋放出的DNA或RNA固定于濾紙上；加標記好的DNA探針，使它與樣品DNA或RNA雜交；洗去未雜交的探針；檢測標記信號并進行判斷。缺點是空白值高。 此法因手工操作程序復雜、繁瑣、費時、容易產生操作錯誤，需要自動化的儀器才能檢測。已有自動化原位雜交

28、儀使得原位雜交更加準確、有效；同時，人們可以從繁瑣的勞動中解放出來。原位雜交儀完成樣品的再水合、蛋白酶K滲入、后固定、預雜交、雜交、雜交后的洗滌、固定及抗體孵化、洗滌等一系列步驟。,固相雜交三要素,探針（DNA、RNA） 要檢測的核酸 （DNA、RNA） 雜交膜： - 硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙,目的：用來檢測經限制性內切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列 雜交方式：DNA-DNA 用途： 基因定位 基因檢測,Southern雜交,Southern雜交操作步驟:（1）核酸的制備：核酸的提取與酶切。 （2）電泳：凝膠電泳分離各酶切片段。 （3）印跡（轉膜）：虹

29、吸印跡、電泳印跡等，將DNA片段轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。 （4） 預雜交：封阻濾膜上非特異性位點，以減少探針的非特異性吸附。（5）雜交：用標記探針與膜上的同源DNA片段特異性結合。 （6）洗脫：去除非特異性結合的探針； （7）檢測：放射性自顯影或化學顯色等方法檢查目的DNA的存在及含量。,核酸分子雜交,特異性的基因探針檢測迅速，靈敏，高度特異。 陽性結果需用標準的培養(yǎng)法加以驗證。 目前已有商品化的基因探針試劑盒。,第四節(jié) PCR法（聚合酶鏈式反應） (Polymerase Chain Reaction, PCR),1985年Kary Mullis等人創(chuàng)立的一種體外酶促擴增特異性DNA片

30、段的方法 體外無限擴增DNA片段，短時間內擴增上百萬倍，提高了檢測能力，能對僅含1個靶DNA分子的樣品進行分析。在分子生物學研究領域、檢測診斷上得到廣泛應用。 Mullis等人獲得了1993年諾貝爾獎。,PCR法,本法通過大量復制目的菌的高度保守的一段或幾段特異性DNA并確認這些DNA片段的大小來完成檢測。如果樣品中存在目的菌，就能復制出有關特異性DNA片段，如果不存在就復制不出有關DNA片段。究竟復制哪一段DNA取決于用于檢測的該DNA兩端的引物的核苷酸序列。因此引物的設計起到關鍵作用。而復制特異性DNA片段靠聚合酶鏈式反應PCR技術。 聚合酶鏈式反應是一種選擇性地體外擴增DNA或RNA的方

31、法，能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易地把皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。 PCR反應體系有：模板核酸、引物、Taq DNA聚合酶、緩沖液、Mg2+、4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、反應溫度與循環(huán)次數、 PCR儀等。 有多種進口與國產的PCR儀用于PCR擴增。儀器的升降溫方式可有氣體加溫、水加溫及電熱塊加溫等。溫度、循環(huán)次數及時間等參數現多用電腦控制?？筛鶕枰x擇儀器。,PCR的原理： 在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。 在變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DN

32、A，再在退火溫度中人工合成的特異引物根據堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結合，然后在DNA聚合酶的作用下，不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導下合成與模板DNA互補的新鏈，實現DNA的擴增。,1、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA 。 2、退火：當溫度突然降低時，反應體系中引物和其互補的DNA模板在局部形成雜交鏈。 3、延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在條件下，53的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。,PCR反應,PCR擴增方式,PCR技術的特點,高度敏感性 高度的特異性 操作簡便、快速

33、 適用樣品廣泛,常規(guī)PCR操作,試劑： 引物：根椐待擴增的DNA片段，設計其特異的上、下游引物。 耐熱DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶。 10PCR緩沖液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.4，20)，150mmol/L MgCl2 ，1mg/ml明膠。 2mmol/L dNTP貯備液：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4種脫氧核苷酸。 ddH2O,PCR反應體系,一、引物 二、模板的制備 三、dNTP、Taq酶、緩沖液、Mg2+濃度及其他 四、聚合酶鏈反應過程和條件 五、檢驗過程與檢驗實例 六、結果判斷 七、假陽性和假陰性的問題 八、其他P

34、CR技術,PCR反應體系,10PCRbuffer 10l dNTPmix 各200mol/L 引物1 1mol/L 引物2 1mol/L DNA模板 50ng-1 g Taq酶 2U 加雙蒸水至總體積為100l,（舉例）,一、引物,有兩種，即5端引物與3 端引物。 5端引物指的是與模板5端序列互補的寡核苷酸， 3端引物是指與模板3 端序列互補的寡核苷酸。擴增的DNA片段就是這兩個引物之間的DNA。引物的設計相當重要，往往根據不同致病菌的高度特異性和保守性的已知核苷酸序列來設計引物。如沙門氏菌的一組叫invA、 invB、 invC、 invD的基因，這種基因在沙門氏菌中廣泛分布，它決定沙門氏菌

35、進入人體上皮細胞的能力，與致病性密切相關，而在非沙門氏菌中尚未發(fā)現。,對引物的其他基本要求, 引物的長度過短會影響PCR的特異性，要求有1825bp，已保證特異性結合；引物過長使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74），亦會影響產物的特異性。 （G+C）含量一般為40%60%。 四種堿基應隨機分布，不要有連續(xù)3個以上的相同嘌呤或嘧啶存在。尤其是引物3端，不應有連續(xù)3個G或C，否則會使引物與核酸的G或C富集區(qū)錯誤互補，從而影響PCR的特異性。 引物自身不應存在互補序列而引起自身折疊，起碼引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。 兩引物之間不應互補，尤其是它們的3端不應互補。一對引物之間不應多

36、于4個連續(xù)堿基有互補性，以免產生引物二聚體。 引物與非特異靶區(qū)之間的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源，否則導致非特異性擴增。 引物3端是引發(fā)延伸點，因此不應錯配。由于ATCG引起錯配有一定規(guī)律，以引物3端A影響最大，因此，盡量避免在引物3端第一位堿基是A。引物3端也不要是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第3位簡并性而影響擴增特異性。 引物5端可以修飾，包括加酶切位點，用生物素、熒光物質、地高辛等標記，引入突變位點，引入啟動子序列，引入蛋白質結合DNA序列等，引物設計最好以電腦軟件進行指導。 反應體系中，引物濃度一般要求在0.1 0.2mol/l 之間。濃度太高，容易生成引物二

37、聚體，或非特異性產物。 引物Tm值與退火溫度有關，技術公式為： Tm =4(G+C)%+2(A+T)%。引物Tm值最好在55 80范圍，以接近72 為最好。,引物設計要遵循的幾條原則,引物的長度以15-30bp為宜。 引物中的堿基分布是隨機的，應盡量避免相同堿基的連續(xù)排列。 （G+C）的含量在45-55%。 避免兩引物間的互補，以免形成引物二聚體。 引物一定要與模板DNA配對；引物必須經GenBank查詢后，證實沒有與其他非目的DNA有高度互補，才能使用。,二、模板的制備,模板的制備是PCR成功的關鍵，對有些食品來說模板的制備是PCR法最難的地方。看用多種方法提取模板。如加熱處理增菌液而不加蛋

38、白酶，使用商業(yè)化的模板提取液等。 PCR反應的關鍵因素主要有引物的選擇與設計、酶的質量和模板的制備，在前兩者都穩(wěn)定可行的情況下， PCR模板的制備尤為重要。 模板處理方法的選擇及操作人員的基本技能，覺得分離模板核酸（DNA或RNA）的質與量、 PCR的成敗以及靈敏度。如肉類樣品中存在脂肪、膠原蛋白、金屬離子以及其他蛋白質抑制PCR，大大降低其靈敏度。而提取模板核酸質量的關鍵是除去雜質（蛋白質、酶、脂肪等），除去抑制Taq 的抑制因子，提高模板核酸的產量。模板中不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、 DNA結合蛋白類物質。,模板核酸的提取制備方法,1、蛋白酶K消化裂解法（傳統(tǒng)法）：蛋白酶

39、K是一種切割活性較廣的非特異性的絲氨酸蛋白酶。它切割脂肪族氨基酸好芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質的一般降解，具有很高的比活性。EDTA等螯合劑不能使蛋白酶K失活。 2、直接裂解法：菌體加磷酸緩沖液或生理鹽水離心洗滌后，加消化裂解液2050l（0.5%NP-40+0.5%吐溫-20），9598，1530min，裂解菌體細胞。然后12000r/min離心5 10min，取上清液2030l用于PCR擴增。NP-40為無色透明液體到白色蠟狀固體，是一類應用極廣的重要非離子表面活性劑。它具有優(yōu)良的去污、濕潤、乳化和分散等表面活性?；蛘哂肅helex-100+ NP-40或Chelex-1

40、00+Triton X-100wei 裂解液。 3、堿變性法：取菌液20 l，加入1mol/l NaOH 20 l，37 30min，離心，加入1mol/l HCl 20 l，離心后，取上清液5 l，用于PCR擴增。本法一般用于革蘭氏陰性菌。 4、煮沸法好高壓滅菌法：經離心洗滌過的菌體，加適量無菌蒸餾水或磷酸緩沖液，混勻后，100煮沸1015min，或經121 15min高壓滅菌， 14000r/min離心10min，取上清液做PCR。 堿變性法和煮沸法的優(yōu)點是簡便快速、試劑簡單，靠水煮和堿性條件使蛋白質裂解、靶基因游離。水煮法無需酚和氯仿，缺點是蛋白或樣本其他組分裂解不完全，高溫和堿可能使模

41、板核酸損傷和丟失。堿法可有酚和氯仿殘留污染，方法穩(wěn)定性重復性欠佳。,三、dNTP、Taq酶、緩沖液、Mg2+濃度及其他, dNTP： dNTP為PCR反應的合成原料。 dNTP濃度取決于擴增片段的長度。每種dNTP濃度應相等，通常濃度范圍為20200mol/L，在此范圍內，PCR產物的量、反應的特異性與忠實性之間的平衡最佳。 TaqDNA聚合酶： TaqDNA聚合酶是從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）YT1株分離提取的。 YT1是一種嗜熱真菌，能在70 75生長。該酶雖然在90以上幾乎無DNA合成，但卻有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍然能保持較高的活性，這是該酶用于

42、PCR反應的前提條件，也是PCR反應能迅速發(fā)展和廣泛應用的原因。 緩沖液：緩沖液提供PCR反應合適的酸堿度與某些離子。在反應過程中pH應保持相對穩(wěn)定，對于Taq酶，一般用10 50mmol/L的Tris-HCl緩沖液把反應體系pH調到8.3 8.8，這樣在擴增過程中溫度達到72時，反應體系pH在7.2左右。 Mg2+： Taq酶的活性需要Mg2+ 。一般采用0.5 5.0mmol/L濃度。 Mg2+濃度過低， Taq酶的活力顯著降低； Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增。 二甲亞砜：當擴增序列中富含GC時，復性時易形成二聚體，加入1g/L的二甲亞砜可破壞模板的二級結構，但具有抑制Taq酶的

43、活性的缺陷。,四、聚合酶鏈反應過程和條件,反應過程包括：變性、退火、延伸三個基本步驟為一個循環(huán)。并不斷重復約2040個循環(huán)。 變性：含目的雙鏈DNA片段的DNA在95下解鏈。 DNA分子中（G+C）含量愈高，要求的變性溫度愈高。太高的變性溫度和時間又會影響Taq酶的活性，通常的變性溫度和時間分別為95 、30，有時用97 、15. 退火：在適當溫度（50 左右）下，加入的一對寡核苷酸引物氫鍵作用與模板上的目的核苷酸序列配對。退火溫度決定PCR反應的特異性，合適的復性溫度應低于引物Tm值的5 。過低引起非特異性擴增；增高可提高特異性，但也會降低擴增效率。因此，一般退火溫度為55 ，時間1min。

44、 延伸：在Taq酶和合成DNA的最適溫度下，以DNA為模板在引物與模板結合基礎上分別合成與引物對應的兩個DNA片段。延伸溫度一般為72 左右，此時Taq酶活性為每秒摻入核苷酸35 100個，2kb的片段用1min已足夠，若DNA片段較長可適當延長擴增時間。 循環(huán)次數：再通過變性使新合成鏈與原模板結合分開，進行新一輪的擴增，合成出一對引物之間的DNA片段。由于此片段較小，可迅速擴增。經25 35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106倍。一般用30個循環(huán)。循環(huán)數主要取決于靶分子濃度。,五、檢驗過程與檢驗實例,六、結果判斷,擴增結束后，取反應液進行凝膠電泳檢查，與已知大小的DNA比較，確定被擴增產物的大小，

45、或用標準菌株擴增產物對照。 如果電泳上得到一條均一的條帶，則認為擴增是特異的。如果不用標準菌株作對照時使用電泳法測定產物大小。電泳涉及致癌物溴化乙錠。現已有自動化DNA片段解析系統(tǒng)。 一般以標準菌株作對照，與樣品菌株DNA靶序列同時復制，確認兩者是否一致。,七、假陽性和假陰性的問題,食品中的抑制劑會影響引物的結合，造成假陰性。食品中的高蛋白、高脂肪都會抑制PCR。低脂肪食品也有抑制PCR反應的，如豆芽。培養(yǎng)基成分也干擾結果。因此一般食品需要二次增菌以去除食物樣品中的抑制因子，并加入特殊緩沖物質（MOPS，3-morpholinopropansesulfonic acid)。二次增菌也可以減少樣

46、品中的死菌及特異性DNA和RNA片段帶來的假陽性。 假陽性還與環(huán)境污染有關，一般是由于模板被污染造成。由于PCR方法高度靈敏，少量的靶分子即可擴增至無限數。因此為防止PCR擴增產物污染環(huán)境而引起以后的PCR假陽性，試劑的貯藏和準備、 PCR反應管的制備、 PCR擴增和PCR產物檢測要在不同的房間里進行。通常將實驗空間分為試劑準備區(qū)、樣品處理區(qū)、反應混合制備和PCR擴增區(qū)、產物分析區(qū)等。而且要嚴格按這一順序排列工作區(qū)。每個工作區(qū)必須配專用的相關儀器設備和所用物品。試劑和耗材不得從某一工作區(qū)移至另一工作區(qū)。 實驗系統(tǒng)中的主要污染有擴增產物污染、試劑污染和樣品污染，其中最主要的污染是擴增產物污染。

47、去污染措施還有：工作前后實驗臺等各個工作部分、器具及熱循環(huán)的部分用10%的次氯酸鈉和水沖洗后進行紫外照射，實驗前后高壓滅菌實驗耗材（反應管、加樣器吸頭等），穿戴干凈手套和衣服等。再以另一個不加模板DNA的作為PCR對照。，對照如果有帶出現，說明被污染。,八、其他PCR技術,多重PCR：使用兩隊以上引物，在同一PCR反應管內同時檢出同一種菌或同時檢測多種病原菌。這種方法保留了常規(guī)PCR的敏感性和特異性，減少了操作步驟和試劑，但擴增率不高、敏感性降低、擴增條件需要摸索協(xié)調、引物之間也可能出現干擾。 巢式PCR：先用一對外側引物擴增含目的基因的大片段，再用一對內側引物以大片段為模板擴增更小片段。由于

48、使用了兩對引物并且進行了兩輪擴增反應，試驗的敏感性和特異性均增強。在一定情況下，這種方法對減少PCR后擴增產物的污染問題極為有用，但它增加了每次試驗的復雜性。,PCR條件的優(yōu)化,1. 反應緩沖液：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室溫），1.5mM MgCl2 pH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強劑 提供緩沖環(huán)境 Mg2+濃度：過高非特異性嚴重，過低無擴增產物 2. Taq DNA聚合酶：熱穩(wěn)定性，2-4U /100l,PCR條件的優(yōu)化,3. 引物：避免反復凍融，引物濃度 0.1-0.5uM之間，過多則非特異擴增增加，過低則擴增產物太少 4. 模板：PCR對模板的要求不高，單、雙

49、鏈DNA均可作為PCR的樣品。 純度：蛋白、多糖、酚類等抑制PCR反應 完整性：模板降解會導致PCR擴增無產物 濃度：濃度適當,PCR條件的優(yōu)化,5. dNTPmix ： 濃度適當，避免反復凍融 常用終濃度為50-400M 6.循環(huán)數：25-35 之間，過多則非特異擴增增加 7. ddH2O pH值適當，避免污染反應,GenBank網址： 使用Blast程序，輸入引物序列，等待結果報告,引物設計網址 /cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi,注意事項,、PCR反應

50、應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行 、防止核酸和核酸酶的污染 、試劑配制應該以大體積配制、分裝、儲存，以確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。,第五節(jié) 實時熒光定量PCR,一、實時熒光定量PCR原理 二、起始模板量的確定 三、實時熒光定量PCR定量方法,實時熒光定量PCR簡介,實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出。與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR產物污染、自動化程度高，同時能對起始模板進行準確定量等特點。常規(guī)PCR只能確定樣品中的合適類型，而且還需要大量的擴增后處理。能克服這些弱點，檢測在一個密閉的試管中進行，無需任何純化或分離步驟

51、，無污染和PCR處理后的風險，可以準確、可靠地對目標核糖體進行檢測，達到定量檢測的目的。 目前在國內使用得比較多的實時熒光定量PCR儀有美國應用生物系統(tǒng)公司(ABI)的7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的LightCycler等。,實時熒光定量PCR簡介,實時熒光定量PCR(Real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ- PCR）是在PCR定性基礎上發(fā)展起來的合適定量技術。它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)控整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了對DNA模板的定量，而

52、且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。,第六節(jié) rRNA及rRNA區(qū)間序列用于快速檢驗,一、16S rRNA 二、 23S rRNA 三、 1623S rRNA,一、16S rRNA,rRNA在細胞中含量大，一個典型的細菌中含有1000020000個核糖體，易于提取，可以獲得足夠的使用量，供比較研究之用。已有許多16S rRNA的特異序列用于致病菌的PCR檢測。 16S rRNA的可變區(qū)位點結構如圖9-22： 可變區(qū)序列因不同細菌而異，保守區(qū)序列則基本恒定。所以可以利用保守區(qū)序列設計引物將16S