免疫學實驗：NK細胞毒檢測

1、1,NK細胞毒檢測,2,自然殺傷細胞（NK）介導天然免疫應答，它不依賴抗體和補體，即能直接殺傷靶細胞，如腫瘤細胞或被病毒感染的細胞等；此外，尚有免疫調節(jié)功能，也參與移植排斥反應和某些自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。 NK細胞活性可作為判斷機體抗腫瘤和抗病毒感染的指標之一。例如在血液系統腫瘤、實體瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性減低；宿主抗移植物反應者，NK活性升高。,NK細胞活性檢測,3,實驗分組及材料 實驗原理 檢測方法 主要操作步驟 結果判定,主 要 內 容,4,器材 75%酒精 若干 5ml注射器 1個/組 100ml燒杯 1個/組 無菌紗網 1塊/組 無菌平皿 1塊/組 無菌吸

2、頭（大、中、?。?盒/room 無菌96孔培養(yǎng)板 1塊/組 無菌離心筒 1個/組 可調微量加樣器 1套/組 細胞計數板 1套/組 顯微鏡 1臺/組 EP管 若干 眼科剪、小鑷子 1套/ 組 細胞培養(yǎng)箱 1臺/room 酶標儀 1臺 離心機 2個/room 超凈臺 1臺/組,動物、細胞及試劑 小鼠 1只/組(NS,OVA) YAC-1 1*106 * 2ml 培養(yǎng)液（DMEM) 無FCS 10ml/組 培養(yǎng)液(DMEM)10%FCS 10ml/組 LDH底物 3ml/組 檸檬酸（終止液） 1ml/組,分組： 每組4人 1只小鼠,實驗分組及材料,5,NK（natural killer ）細胞屬非特

3、異性免疫細胞，為機體的天然免疫系統中主要的效應細胞，是與T、B細胞并列的第三類群淋巴細胞。 NK細胞可非特異直接殺傷靶細胞，這種天然殺傷活性既不需要預先由抗原致敏，也不需要抗體參與，且無MHC限制。 YAC-1細胞為Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤細胞，對NK細胞敏感，可用于檢測NK細胞的殺傷活性。,原 理,通過殺傷激活受體（KAR）直接識別,通過抗體間接識別：ADCC,分泌殺傷介質： perforin granzyme TNF IFN,清除異常細胞 （腫瘤、病原體感染）,NK細胞功能：清除異常細胞,通過殺傷激活受體（KAR）直接識別,通過抗體間接識別：ADCC,實

4、驗原理,NK細胞+靶細胞,靶細胞破裂,釋放內容物,胞漿內酶類 LDH酶活性,胞漿內蛋白 放射性鉻酸鈉 51Cr標記,DNA 3H-TdR摻入,10,密度梯度離心 Ficoll 密度梯度離心 Percoll密度梯度離心 磁化細胞分離器分離法,NK細胞分離方法,11,同位素釋放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR 乳酸脫氫酶釋放法 (本次實驗采用),常用的檢測方法,12,G0,G1,S,Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR,New DNA Or Protein,cpm,同位素釋放法,13,應用放射性同位素（ 如51Cr）標記靶細胞，當靶細胞受到NK細胞攻擊，靶細胞被破壞，

5、釋放出51Cr。51Cr輻射射線，通過測定受損傷或死亡靶細胞釋放到上清中51Cr的放射脈沖數(cpm)，即可計算出NK細胞毒活性。,同位素釋放法,14,乳酸脫氫酶(LDH)存在于細胞內，正常情況下，不能透過細胞膜。當細胞受到損傷時，LDH可從細胞內釋放至培養(yǎng)液中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶(NADH)，后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(INT)或硝基氯化四氮唑藍(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波長處有一吸收峰，利用讀取的值，可測得殺傷細胞毒活性。,乳酸脫氫酶釋放法-原理,15,靶細胞 YAC

6、-1,NK 殺傷,LDH 釋放到細胞外,無色底物,LDH底物,還 原,有色物質,測OD570值,乳酸脫氫酶釋放法,靶細胞 膜損傷,最大釋放均值（Max）=最大釋放孔cpm均值-最大釋放對照孔cpm均值 自發(fā)釋放均值（S自發(fā)）=自發(fā)釋放孔cpm均值-培養(yǎng)基對照孔cpm均值,殺傷率( %)=,Max- S自發(fā),實驗值-自發(fā)釋放值,100,16,操作流程,1W,無菌取脾 研磨成單細胞懸液+2ml 1640（無FBS),細胞計數 【?/ml】 取20ul細胞+980ul的1640 混勻后取出20ul細胞+20ul臺盼藍,加板(三復孔) (加法見附圖),調細胞濃度 1107 /ml,5%CO2 37培養(yǎng)

7、2小時,離心，取100ul上清移入新孔， 37孵育10min,加入底物 100ul/well 室溫避光孵育15min,30l /孔 1mol/L檸檬酸,酶標儀測吸光度值：OD570nm,結果判定：,培養(yǎng)YAC1細胞 10%FBS1640培養(yǎng)液,調細胞濃度 1106/ml,17,單細胞懸液的制備 小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡消毒2-3分鐘。 于超凈臺內取出脾組織，放入預先盛有5ml 1640培養(yǎng)液的平皿內。 用紗網包裹住脾組織，將脾剪成小塊，用5ml注射器塞輕壓使脾細胞透過紗網。然后用1000ul加樣器隔著紗網將細胞懸液吸出，放入50ml 離心管中，再分別用1ml培養(yǎng)液沖洗紗網和平皿，并將細胞懸

8、液吸出，放入同一50ml離心管中，剩余3ml培養(yǎng)液備用。 1000rpm，常溫離心10分鐘，棄上清，加1ml 1640培養(yǎng)液重懸細胞。 細胞計數： 取上述制備好的細胞懸液混勻后取出20ul，加到盛有980ul計數液的EP管中，混勻后取出20ul到一個新的EP管中，再向其中加入20ul臺盼藍染料，混勻后取20ul計入到細胞計數版上，在顯微鏡下計數，計數方法見后。 調脾細胞濃度至1108/ml，每組所需總量為1ml 調YAC1細胞濃度至1106/ml，每組需2ml 注意:在稀釋前一定將原細胞懸液混勻，否則細胞長時間沉淀使細胞數不準。,實驗步驟,18,細胞培養(yǎng)： 按圖所示加板。 將板做好標記，在倒置

9、顯微鏡下觀察細胞，然后放于37 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2小時。 LDH底物： 在培養(yǎng)2小后，1000rpm，離心5min，取100ul上清液移入新孔內，于每孔內加入LDH底物 100ul，加完后輕輕搕板，使之混勻。 室溫避光保存15min。 取出，加入1mol/L檸檬酸， 30l /孔。酶標儀讀數前保證沒有氣泡。 結果測定： 結果測量：用酶標儀測定光密度值：OD570nm。記錄結果。 結果判定： Max （ 靶細胞最大釋放）=最大釋放孔均值-最大釋放對照孔均值 S自發(fā) （靶細胞自發(fā)釋放） =自發(fā)釋放孔均值-培養(yǎng)基對照孔均值 注： S自發(fā) 0，做“0”處理,實 驗 步 驟,SI=,Max- S自發(fā),實驗孔值-自然釋放孔值,100%,19,Max=E-F S自