實(shí)時(shí)熒光定量PCR對丙肝RNA檢測的影響因素

1、1,實(shí)時(shí)熒光定量PCR對丙肝RNA檢測的影響因素,2,丙肝RNA檢測影響因素,實(shí)驗(yàn)室條件影響因素 標(biāo)本影響因素 核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過程的影響因素,3,實(shí)驗(yàn)室條件影響因素,實(shí)驗(yàn)室設(shè)置 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室工作人員,4,實(shí)驗(yàn)室條件實(shí)驗(yàn)室設(shè)置,根據(jù)衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法(衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號)規(guī)定“臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；標(biāo)本制備區(qū)；擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。”,5,實(shí)驗(yàn)室條件實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備,各實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其

2、他區(qū)域的儀器設(shè)備混用。,6,實(shí)驗(yàn)室條件實(shí)驗(yàn)室工作人員,應(yīng)具備良好的分子生物學(xué)專業(yè)技術(shù)操作規(guī)范。 方向：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)核酸制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū),7,標(biāo)本影響因素,抗凝劑 溶血 脂血 標(biāo)本的保存,8,標(biāo)本影響因素 抗凝劑,用于丙肝RNA測定最好使用EDTA抗凝全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，嚴(yán)禁使用肝素，因其對PCR擴(kuò)增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除。如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2小時(shí)內(nèi)）分離血清。,9,標(biāo)本影響因素 溶血,由于溶血標(biāo)本中存在的血紅蛋白可以抑制Taq酶的活性，致使定量結(jié)果偏低，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。雖然目前大多數(shù)熒光定量PCR試劑盒使用核酸提取柱提取RNA,該方法操作

3、簡便快速，有實(shí)驗(yàn)表明，即使存在高濃度血紅蛋白等干擾物質(zhì)在用柱抽提的過程中被完全去除，為模板的核酸得到了高度純化，從而可以避免樣本溶血對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。但是血細(xì)胞破裂會(huì)有大量核糖核酸酶（RNsae）釋放而使提取模版的RNA降解，這必然導(dǎo)致定量結(jié)果降低，因此被檢樣品決不能溶血。,10,標(biāo)本影響因素 脂血,未經(jīng)處理的脂血標(biāo)本在加樣過程中因脂肪顆粒占有一定體積 而引起血清加樣量相對減少 。 脂肪或其代謝產(chǎn)物也能與Taq酶相互作用，抑制Taq酶的活性，擴(kuò)增效率明顯降低，導(dǎo)致檢測結(jié)果降低。 有研究表明：在較高水平的病毒載量的標(biāo)本中 ，擴(kuò)增效率與HCV-RNA定量檢測水平不發(fā)生明顯的數(shù)量級改變，而在低水平的

4、病毒載量的標(biāo)本中，脂血標(biāo)本對檢測結(jié)果有明顯的干擾作用。,11,標(biāo)本影響因素 標(biāo)本的保存,由于RNA為單鏈，極不穩(wěn)定，且易被RNase所降解，因此應(yīng)在取血后盡快提取RNA，如不能做到，則需要分離出血漿或血清進(jìn)行冷凍保存，短期（1-2周）保存可在-20oC下，較長期保存應(yīng)在-70oC。有研究表明，-20oC存放 7個(gè)半月后臨界標(biāo)本完全降解而其他標(biāo)本結(jié)果稍有下降，因此標(biāo)本不宜保存太長時(shí)間。,12,核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過程的影響因素,核酸提取又稱標(biāo)本處理，這一階段人為因素影響最大，因此要求需由具有專門經(jīng)驗(yàn)和經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作，操作人員應(yīng)穿工作服，戴一次性手套并經(jīng)常替換。,13,核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過程的影

5、響因素,由于RNA病毒檢測較一般DNA病毒檢測復(fù)雜，在裂解HCV顆粒，提取RNA，沉淀RNA，反轉(zhuǎn)錄中均有很多影響結(jié)果因素需要注意，其中最重要的是防止RNase污染和提取不充分。,14,核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過程的影響因素,核酸提取過程中經(jīng)常需要離心操作，離心最好使用低溫高速離心機(jī)，離心速度和時(shí)間一定要按要求，否則可能造成RNA提取不完全，而使定量結(jié)果降低，甚至出現(xiàn)假陰性。,15,總之，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HCV-RNA的影響因素非常多，比如不同核酸提取方法對同一臨床標(biāo)本HCV-RNA核酸提取效率差異也很大。有研究指出，簡化了的酸性異硫氰酸胍一酚一氯仿RNA提取方法表現(xiàn)出提取效率低和重復(fù)性差，不適宜應(yīng)用于HCV-RNA定量試驗(yàn)，磁性硅膠分離技術(shù)法和柱式離心分離技術(shù)法都顯示了較高的HCV-RNA提取效率和收獲RNA的質(zhì)量，以及定量試驗(yàn)中較好的方法性能。所以在實(shí)際工作過程中除了需要注意以上幾點(diǎn)外還