MALBAC單細(xì)胞全基因組測(cè)序詳細(xì)解析

1、單細(xì)胞全基因組測(cè)序一直是生物學(xué)家夢(mèng)想得到的結(jié)果。但是其中必須解決的矛盾：1.線性擴(kuò)增。如果用全基因組PCR擴(kuò)增，因?yàn)镻CR的擴(kuò)增偏向性（bias），再加上PCR過程中較小的偏向性通過指數(shù)放大，其結(jié)果就會(huì)是嚴(yán)重的覆蓋不均一，導(dǎo)致在許多地方只有很低的覆蓋、甚至沒有覆蓋。所以，保證模板被線性地?cái)U(kuò)增，是首要問題。2.全基因組覆蓋。常規(guī)的建庫方法，因?yàn)檠a(bǔ)平、加A、接頭連接效率的問題，起始DNA中有很大一部分會(huì)被浪費(fèi)，沒有形成有效文庫分子（也就是兩頭都接好引物的DNA片段）。在單細(xì)胞測(cè)序中，這是不可接受的。3.高擴(kuò)增效率。單細(xì)胞中的每個(gè)基因位置理論上都只有2個(gè)拷貝，而要從2個(gè)拷貝擴(kuò)增到足夠建立文庫的DNA

2、量，要經(jīng)過許多次的擴(kuò)增。這就需要很高的擴(kuò)增效率。而一般的線性擴(kuò)增很難有好的擴(kuò)增效率謝曉亮教授創(chuàng)新的MALBAC方法（multiple annealing andlooping-based amplification cycles），一舉解決了上述3個(gè)問題，達(dá)到：1. 線性擴(kuò)增，2. 近乎全覆蓋，3. 高擴(kuò)增效率（高產(chǎn)量），并且最終可以用于檢測(cè)單細(xì)胞的CNV。原理：1.第一步A. 用5端有27個(gè)統(tǒng)一序列，而3端是8個(gè)隨機(jī)序列的引物，作為擴(kuò)增引物。用隨機(jī)引物保證可以在模板鏈上的各處隨機(jī)結(jié)合B.0淬火，再65等溫?cái)U(kuò)增，得到第一輪的復(fù)制的產(chǎn)物a. n個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物（在圖中標(biāo)成藍(lán)色），這些擴(kuò)增產(chǎn)物都有在5端

3、有一個(gè)統(tǒng)一的引物b. 1個(gè)原來的模板（在圖中標(biāo)成黑色）C. 用有前鏈移開功能的聚合酶（29聚合酶）來進(jìn)行擴(kuò)增，這種酶的特點(diǎn)是會(huì)把酶前行方向上的前鏈從原來的模板鏈上進(jìn)行解鏈、移開。利用這種特點(diǎn)，可以讓模板上的每個(gè)點(diǎn)在第一輪反應(yīng)中，都有機(jī)會(huì)得到n個(gè)拷貝D.巧妙之處：a.0淬火，在延伸開始之前，就把n個(gè)引物雜交到模板上b.29聚合酶可以把前面的鏈給推開，結(jié)合前面的淬火步驟，一次復(fù)制出n個(gè)擴(kuò)增子2.第2輪起的m輪擴(kuò)增A. 每個(gè)循環(huán)a. 先0淬火，再65擴(kuò)增b. 粘到第一輪所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物上的引物，又會(huì)產(chǎn)生一輪擴(kuò)增。其產(chǎn)物5端帶有統(tǒng)一引物序列，3端帶有與統(tǒng)一引物序列，稱為完整擴(kuò)增產(chǎn)物c. 粘到原始模板上

4、的引物，也產(chǎn)生一輪擴(kuò)增。但是其產(chǎn)物是只在5端帶有統(tǒng)一引物序列，而在3端沒有統(tǒng)一引物序列，稱為半擴(kuò)增產(chǎn)物d. 98解鏈e. 58保溫，讓完整產(chǎn)物的兩端發(fā)生鏈內(nèi)雜交，復(fù)性后3端的序列不再能與游離的互補(bǔ)引物發(fā)生雜交，這就阻止了指數(shù)擴(kuò)增。B. 重復(fù)A步驟中從ae的5個(gè)步驟，共5次。經(jīng)過m個(gè)循環(huán)后，得到：a. m* n2個(gè)“完整擴(kuò)增產(chǎn)物”b. (m+1)* n個(gè)“半擴(kuò)增產(chǎn)物”c. 1個(gè)原始模板C.巧妙之處：a. 線性擴(kuò)增i. 其巧妙之處在于，每個(gè)循環(huán)的最后，加了一步58退火。這一退火過程，讓完整擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端發(fā)生鏈內(nèi)雜交。這樣3端的序列就不能與新的游離引物發(fā)生雜交，也就不會(huì)引發(fā)起始于3端的擴(kuò)增，也就是避

5、免了“完整擴(kuò)增產(chǎn)物”的自我指數(shù)擴(kuò)增。ii. 如果發(fā)生以8個(gè)隨機(jī)堿基為引物3末端的指數(shù)擴(kuò)增，3末端的堿基序列不一致性就會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的Bias，再經(jīng)過指數(shù)放大，就會(huì)變成明顯的擴(kuò)增效率Bias。iii. 現(xiàn)在，還是8個(gè)隨機(jī)堿基的引物在模板上隨機(jī)地找結(jié)合位點(diǎn)，所有位點(diǎn)的被擴(kuò)增機(jī)會(huì)大致均等。iv. 完整產(chǎn)物的數(shù)量是m * n2，也就是說，擴(kuò)增產(chǎn)物與m成正比，而不是與m2成正比，更不是與2m成正比。也就是說擴(kuò)增產(chǎn)物與擴(kuò)增的次數(shù)成線性關(guān)系。這達(dá)成了單細(xì)胞測(cè)序所要求的：線性擴(kuò)增。b. 全基因組覆蓋i. 再次利用29聚合酶的前鏈移開功能，在一個(gè)模板上擴(kuò)增出多個(gè)擴(kuò)增子。這樣從第1輪擴(kuò)增開始，每個(gè)模板就會(huì)得到多個(gè)

6、擴(kuò)增子。再加上以后5輪的擴(kuò)增中，原始模板都有機(jī)會(huì)再次被擴(kuò)增出多個(gè)擴(kuò)增子。這樣本保證每個(gè)原始模板都產(chǎn)生n個(gè)擴(kuò)增子。建庫時(shí)被漏掉一些擴(kuò)增子，還是能保證大多數(shù)的基因組區(qū)域可以被建成庫c. 高擴(kuò)增效率i. 在擴(kuò)增中，所得到的 “完整擴(kuò)增產(chǎn)物”的個(gè)數(shù)是m * n2個(gè)。這個(gè)“n2”，還是利用了29聚合酶的“前鏈移開功能“，保證了擴(kuò)增有較高的效率?？梢缘玫捷^多的擴(kuò)增產(chǎn)物，以供下面的實(shí)驗(yàn)之用。結(jié)果1. Lorenz曲線可以從上面的Lorenz曲線中看出來，MALBAC方法的覆蓋均一性明顯好于MDA方法，但還是弱于大批量細(xì)胞的測(cè)序結(jié)果。藍(lán)箭頭和綠箭頭，分別指出MALBAC方法和MDA方法沒有測(cè)到序列部分占全基因

7、組的比例。2. CNV3. A、B、C、D中的綠線是按Markov模型估算出來的CNV數(shù)4. A、B、C，分別是3個(gè)單細(xì)胞MALBAC方法測(cè)序后的覆蓋率。5. D是大量細(xì)胞測(cè)序后的覆蓋率。6. E是MDA方法測(cè)序后的覆蓋率。7. 測(cè)序的深度都是平均25倍。參考文獻(xiàn)：Chenghang Zong1, Sijia Lu1, Alec R. Chapman, X. Sunney Xie. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science 21 December 2012:Vol. 338 no. 6114 pp. 1622-1626Rubicon