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1、 第5章:研究方法-基因克隆 導(dǎo)言:克隆技術(shù) 克隆的現(xiàn)代含義 基因克隆 基因克隆策略 基因克隆相關(guān)技術(shù) Clone 翻譯過(guò)來(lái) 克隆 “Clone”起源于希臘文“Klone”,原意: 用“嫩枝”或“插條”繁殖。 最初意義 無(wú)性繁殖 現(xiàn)代意義 兩個(gè)詞性、三層含義 動(dòng)詞,通過(guò)某種操作比如顯微操作、分子生 物學(xué)操作來(lái)獲得與某種祖先相同的分子、 細(xì)胞、個(gè)體的過(guò)程。 名詞,通過(guò)上述操作獲得的遺傳上與祖先相 同的分子、細(xì)胞、個(gè)體。 5.5基因文庫(kù)的篩選 當(dāng)作名詞時(shí),克隆是指由遺傳組成完全相同的分子、細(xì)胞或個(gè)體組成的一個(gè)群體。例如, DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷貝; 細(xì)胞

2、克隆則是來(lái)源于同一祖細(xì)胞的、基因型完全相同的一群子細(xì)胞; 個(gè)體克隆則是指基因型相同的個(gè)體的拷貝。 當(dāng)作動(dòng)詞是指運(yùn)用DNA重組技術(shù)將一個(gè)特定的基因或DNA序列輸入一個(gè)載體分子;也指分離出單個(gè)分子、基因或細(xì)胞后使之增殖成一個(gè)群體,當(dāng)然也包括復(fù)制個(gè)體的一系列實(shí)驗(yàn)操作。 在分子生物學(xué)中特指基因克?。╣ene cloning) 指的是從基因組中把某個(gè)基因分離出來(lái),再把它重組在合適的載體上,使之增殖成許多拷貝的過(guò)程。 這里面含有幾層意思: 1、要知道這個(gè)基因的序列如何; 2、要搞清楚這個(gè)基因位于基因組那條染色體上,位置關(guān)系如何; 3、要把這個(gè)基因的序列放置在某種載體分子上以便能夠獲得它的多個(gè)拷貝。 5.5

3、 基因克隆(gene cloning) 指的是從基因組中把某個(gè)基因分離出來(lái),再把它重組在合適的載體上,使之增殖成許多拷貝的過(guò)程。 基因克?。╣ene cloning)是指某種目的基因的分離過(guò)程,通常是從基因組或DNA大片段中分離并獲得某一特定的基因或DNA片段,再通過(guò)DNA 序列擴(kuò)增形成由眾多拷貝組成的DNA拷貝群體的過(guò)程。 幾層意思: 1、要知道這個(gè)基因的序列如何; 2、要搞清楚這個(gè)基因位于基因組那條染色體上,位置關(guān)系如何; 3、把這個(gè)基因的序列放置在某種載體分子上以便能夠獲得它的多個(gè)拷貝 基因克隆的一般策略 1 已知序列基因的克隆 概述: 對(duì)已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡(jiǎn)便的一種

4、。獲取基因序列多從文獻(xiàn)中查取,即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)。 現(xiàn)在國(guó)際上公開(kāi)發(fā)行的雜志一般都不登載整個(gè)基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫(kù)中注冊(cè),擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)(accessionnumber),以便別人參考和查詢 已知序列的來(lái)源 對(duì)已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡(jiǎn)便的一種。獲取基因序列多從文獻(xiàn)中查取,即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)?,F(xiàn)在國(guó)際上公開(kāi)發(fā)行的雜志一般都不登載整個(gè)基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫(kù)中注冊(cè),擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫(kù)中的注冊(cè)號(hào)(accessi

5、on number),以便別人參考和查詢。 目前,世界上主要的基因庫(kù)有: (1)EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫(kù),其網(wǎng)上地址為http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,為設(shè)在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫(kù),其網(wǎng)上地址為/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL, Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫(kù),其所含序列的準(zhǔn)確度比較高,而TREMBL只含有從EMBL庫(kù)中翻譯過(guò)來(lái)的序列。 目前,以Genbank的應(yīng)用最頻繁。這些基因庫(kù)是相互聯(lián)系的

6、,在Genbank注冊(cè)的基因序列,也可能在Swissport注冊(cè)。要克隆某個(gè)基因可首先通過(guò)Internet查詢一下該基因或相關(guān)基因是否已經(jīng)在基因庫(kù)中注存。 查詢所有基因文庫(kù)都是免費(fèi)的,因而極易將所感興趣的基因從庫(kù)中拿出來(lái),根據(jù)整個(gè)基因序列設(shè)計(jì)特異的引物,通過(guò)PCR從基因組中克隆該基因,也可以通過(guò)RT-PCR克隆cDNA。 2 表型或功能克隆 1、定義 表型克隆(phenotypic cloning)或者稱為功能克?。╢unctional cloning)、差異基因克隆。 從功能出發(fā),利用特定組織細(xì)胞器官與正常組織細(xì)胞器官DNA或RNA水平上的差異,進(jìn)行相關(guān)基因的分離與克隆,這些基因表達(dá)變化是與

7、可檢測(cè)的表型變化直接聯(lián)系的,故稱為表型克隆,這些表型變化又是與某種生理功能緊密相關(guān)的,所以又稱為功能克隆。 產(chǎn)物已知基因的功能克隆方法 (適用于產(chǎn)物和功能已知的基因) 尋找表型異常 找出導(dǎo)致表型異常的 異常功能蛋白質(zhì) 根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)DNA序列 以此為探針 篩查基因文庫(kù)或cDNA文庫(kù) 克隆這種異常蛋白質(zhì)的編碼基因 產(chǎn)物序列未知基因的功能克隆方法 (適用于功能已知、產(chǎn)物未知的基因) mRNA差異展示(mRNA differential display,DDRT-PCR) 代表性差示分析(representational difference analysis,RDA) 抑制性差減雜交(supp

8、ression subtractive hybridization,SSH) 差異消減展示(differential subtraction display,DSD) 5.5.1 RACE技術(shù) (rapid-amplification of cDNA ends) 5 RACE 3 RACE classic RACE The SMART RACE: Switching Mechanism At 5 end of RNA Transcript. The Takala RACE 經(jīng)典的RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 主要通過(guò)RT-PCR技術(shù)由已知部分c

9、DNA序列來(lái)得到完整的cDNA5和3端,包括單邊PCR和錨定PCR。 完整的cDNA 序列可以通過(guò)文庫(kù)的篩選和末端克隆技術(shù)獲得。 特點(diǎn):從一個(gè)相同的cDNA模板進(jìn)行5和3末端快速克隆的方法。 首要條件: 至少獲得mRNA的2328個(gè)核苷酸序列信息,以此來(lái)設(shè)計(jì)5末端和3末端RACE反應(yīng)的基因特異性引物(gene specific primer,GSP) 克隆目標(biāo)cDNA全長(zhǎng)3種情況,3種策略 5 RACE(通常用于已知3求5) 1 利用已知基因片段,設(shè)計(jì)基因特異的引物GSP1,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成cDNA第一鏈; 2 用RNAase H降解雜合鏈中的mRNA, 3 末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA

10、3端增加oligodC, 4 針對(duì)oligodC 設(shè)計(jì)錨定引物,以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增出5端 3 RACE(通常用于已知5 求3) 1 利用已知基因片段3末端的polyA,設(shè)計(jì)錨定引物oligodT(引物3端增加兩個(gè)兼并引物),在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成cDNA第一鏈; 2 用RNAase H降解雜合鏈中的mRNA, 3 利用基因特異的引物GSP和錨定引物進(jìn)行PCR 5.5.2 cDNA差示分析法克隆基因 前提:利用兩套cDNA:tester和driver,其中tester中含有少數(shù)dirver中不具有的cDNA即差異基因,除此之外,二者完全相同。 原理1:利用差減雜交,去除相同的部分 原理

11、2:利用增加接頭的方法,特異指示tester, 原理3:利用PCR的指數(shù)擴(kuò)增,篩選差異基因 cDNA差示分析法克隆基因-RDA RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板,而以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性,通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法,特異擴(kuò)增了目的基因片段。 因?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象(Tester)和供試探針(Driver)在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理,形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群(representation),保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。 每次T減D反應(yīng)中兩者物質(zhì)的量比就要求達(dá)到1:100或更高,經(jīng)過(guò)2-3次重復(fù),T群體非特異性序列幾乎沒(méi)有偶然逃脫的

12、可能性。 5.3.3 Gateway大規(guī)模克隆技術(shù)(了解) 說(shuō)明:gateway并不是上述克隆基因的技術(shù),而只是一種大規(guī)模將目的基因從克隆載體轉(zhuǎn)向表達(dá)載體的方法 兩步完成: TOPO反應(yīng):PCR產(chǎn)物連入Entry載體 LR反應(yīng):PCR產(chǎn)物從Entry載體重組入表達(dá)載體 5.5.4基因的圖位克隆 (map-based cloning or Positional cloning ) 根據(jù)遺傳連鎖分析和染色體步移法,將基因定位到染色體的一個(gè)具體位置上,通過(guò)篩選基因組文庫(kù)來(lái)克隆基因。 定位克隆的核心是連鎖分析技術(shù) 連鎖分析即通過(guò)基因與基因之間的重組系數(shù)來(lái)估計(jì)這兩者之間的距離,若某種性狀的基因與另外一個(gè)

13、基因在子代不分離,即有連鎖在一起的趨勢(shì)。根據(jù)已知基因的染色體位置來(lái)判斷未知的連鎖基因的染色體位置。 但是已知的基因與未知基因存在連鎖關(guān)系的并不多,所以連鎖分析對(duì)克隆大多數(shù)基因存在著一定的困難。 RFLP等分子標(biāo)記的出現(xiàn)使多態(tài)性基因標(biāo)記存在于整個(gè)基因組內(nèi),解決了連鎖分析中難以克服的困難。 尋找連鎖基因就轉(zhuǎn)變成了尋找連鎖標(biāo)記。 定位克隆的前提條件 1、建立相應(yīng)的文庫(kù), 例如BAC、YAC庫(kù)。 2、要有合適的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記做篩庫(kù)的探針。 基因定位克隆步驟(map-based cloning) (用于分離其編碼產(chǎn)物未知的基因,理論上任何一個(gè)有突變的基因都可以通過(guò)這種方法克隆出來(lái)) (1)

14、根據(jù)突變通過(guò)家系分析等將基因定位在染色體上,并在目的基因兩側(cè)確定一對(duì)緊密連鎖的分子標(biāo)記(RFLP等); (2)利用這對(duì)分子標(biāo)記作探針,通過(guò)染色體步移(chromosome walking) 技術(shù)或者染色體顯微切割技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含有目的基因的基因組片段克隆并分離出來(lái); (3)確定含有目的基因的染色體片斷,也就是再進(jìn)一步做出更精細(xì)的染色體圖譜; (4)最后在這些片段中進(jìn)一步篩選目的基因,并作突變檢測(cè)驗(yàn)證和功能分析(一般是通過(guò)遺傳互補(bǔ)完成) 染色體步移法圖示 Chromosome walking 染色體步移的起點(diǎn)是具有一個(gè)與待分離的目的基因盡可能靠近的已經(jīng)鑒定的分子標(biāo)記。這種標(biāo)記可以

15、是RFLP,也可以是已知的基因克隆。 先構(gòu)建起點(diǎn)RFLP標(biāo)記克隆的限制圖,并把其中最靠近目的基因的限制片段亞克隆出來(lái)。此限制片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后,用作分子雜交探針,從基因組文庫(kù)中篩選與起點(diǎn)克隆具有重疊序列的新克隆(稱之為一步克?。V貜?fù)進(jìn)行上述的各個(gè)步驟。構(gòu)建一步克隆的限制圖,亞克隆其中最靠近目的基因的限制片段,該片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后,用作分子雜交探針從基因組文庫(kù)中篩選與一步克隆具有重復(fù)序列的新克隆(稱之為二步克?。?。如此重復(fù)進(jìn)行多次,每得到一個(gè)新的克隆都更接近目的基因一步,直至最后獲得了目的基因的克隆。由于這種技術(shù)是通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列,而慢慢靠近目的基因

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