分子生物學(xué)-11-1-第五章基因克隆技術(shù)

1、 第5章：研究方法-基因克隆 導(dǎo)言：克隆技術(shù) 克隆的現(xiàn)代含義 基因克隆 基因克隆策略 基因克隆相關(guān)技術(shù) Clone 翻譯過來 克隆 “Clone”起源于希臘文“Klone”，原意： 用“嫩枝”或“插條”繁殖。 最初意義 無性繁殖 現(xiàn)代意義 兩個詞性、三層含義 動詞，通過某種操作比如顯微操作、分子生 物學(xué)操作來獲得與某種祖先相同的分子、 細胞、個體的過程。 名詞，通過上述操作獲得的遺傳上與祖先相 同的分子、細胞、個體。 5.5基因文庫的篩選 當(dāng)作名詞時，克隆是指由遺傳組成完全相同的分子、細胞或個體組成的一個群體。例如， DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷貝； 細胞

2、克隆則是來源于同一祖細胞的、基因型完全相同的一群子細胞； 個體克隆則是指基因型相同的個體的拷貝。 當(dāng)作動詞是指運用DNA重組技術(shù)將一個特定的基因或DNA序列輸入一個載體分子；也指分離出單個分子、基因或細胞后使之增殖成一個群體，當(dāng)然也包括復(fù)制個體的一系列實驗操作。 在分子生物學(xué)中特指基因克隆（gene cloning） 指的是從基因組中把某個基因分離出來，再把它重組在合適的載體上，使之增殖成許多拷貝的過程。 這里面含有幾層意思： 1、要知道這個基因的序列如何； 2、要搞清楚這個基因位于基因組那條染色體上，位置關(guān)系如何； 3、要把這個基因的序列放置在某種載體分子上以便能夠獲得它的多個拷貝。 5.5

3、 基因克隆（gene cloning） 指的是從基因組中把某個基因分離出來，再把它重組在合適的載體上，使之增殖成許多拷貝的過程。 基因克隆（gene cloning）是指某種目的基因的分離過程，通常是從基因組或DNA大片段中分離并獲得某一特定的基因或DNA片段，再通過DNA 序列擴增形成由眾多拷貝組成的DNA拷貝群體的過程。 幾層意思： 1、要知道這個基因的序列如何； 2、要搞清楚這個基因位于基因組那條染色體上，位置關(guān)系如何； 3、把這個基因的序列放置在某種載體分子上以便能夠獲得它的多個拷貝 基因克隆的一般策略 1 已知序列基因的克隆 概述： 對已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡便的一種

4、。獲取基因序列多從文獻中查取,即將別人報道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)。 現(xiàn)在國際上公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫中注冊,擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫中的注冊號(accessionnumber),以便別人參考和查詢 已知序列的來源 對已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡便的一種。獲取基因序列多從文獻中查取,即將別人報道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)。現(xiàn)在國際上公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫中注冊,擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫中的注冊號(accessi

5、on number),以便別人參考和查詢。 目前,世界上主要的基因庫有: (1)EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實驗室的基因庫,其網(wǎng)上地址為http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,為設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫,其網(wǎng)上地址為/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL, Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫,其所含序列的準(zhǔn)確度比較高,而TREMBL只含有從EMBL庫中翻譯過來的序列。 目前,以Genbank的應(yīng)用最頻繁。這些基因庫是相互聯(lián)系的

6、,在Genbank注冊的基因序列,也可能在Swissport注冊。要克隆某個基因可首先通過Internet查詢一下該基因或相關(guān)基因是否已經(jīng)在基因庫中注存。 查詢所有基因文庫都是免費的,因而極易將所感興趣的基因從庫中拿出來,根據(jù)整個基因序列設(shè)計特異的引物,通過PCR從基因組中克隆該基因，也可以通過RT-PCR克隆cDNA。 2 表型或功能克隆 1、定義 表型克?。╬henotypic cloning）或者稱為功能克隆（functional cloning）、差異基因克隆。 從功能出發(fā)，利用特定組織細胞器官與正常組織細胞器官DNA或RNA水平上的差異，進行相關(guān)基因的分離與克隆，這些基因表達變化是與

7、可檢測的表型變化直接聯(lián)系的，故稱為表型克隆，這些表型變化又是與某種生理功能緊密相關(guān)的，所以又稱為功能克隆。 產(chǎn)物已知基因的功能克隆方法 （適用于產(chǎn)物和功能已知的基因） 尋找表型異常 找出導(dǎo)致表型異常的 異常功能蛋白質(zhì) 根據(jù)氨基酸序列推導(dǎo)DNA序列 以此為探針 篩查基因文庫或cDNA文庫 克隆這種異常蛋白質(zhì)的編碼基因 產(chǎn)物序列未知基因的功能克隆方法 （適用于功能已知、產(chǎn)物未知的基因） mRNA差異展示（mRNA differential display,DDRT-PCR） 代表性差示分析（representational difference analysis,RDA） 抑制性差減雜交（supp

8、ression subtractive hybridization,SSH） 差異消減展示（differential subtraction display,DSD） 5.5.1 RACE技術(shù) (rapid-amplification of cDNA ends) 5 RACE 3 RACE classic RACE The SMART RACE: Switching Mechanism At 5 end of RNA Transcript. The Takala RACE 經(jīng)典的RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 主要通過RT-PCR技術(shù)由已知部分c

9、DNA序列來得到完整的cDNA5和3端，包括單邊PCR和錨定PCR。 完整的cDNA 序列可以通過文庫的篩選和末端克隆技術(shù)獲得。 特點：從一個相同的cDNA模板進行5和3末端快速克隆的方法。 首要條件： 至少獲得mRNA的2328個核苷酸序列信息，以此來設(shè)計5末端和3末端RACE反應(yīng)的基因特異性引物（gene specific primer，GSP） 克隆目標(biāo)cDNA全長3種情況，3種策略 5 RACE(通常用于已知3求5) 1 利用已知基因片段，設(shè)計基因特異的引物GSP1，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA第一鏈； 2 用RNAase H降解雜合鏈中的mRNA， 3 末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA

10、3端增加oligodC， 4 針對oligodC 設(shè)計錨定引物，以第一鏈cDNA為模板擴增出5端 3 RACE(通常用于已知5 求3) 1 利用已知基因片段3末端的polyA，設(shè)計錨定引物oligodT（引物3端增加兩個兼并引物），在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA第一鏈； 2 用RNAase H降解雜合鏈中的mRNA， 3 利用基因特異的引物GSP和錨定引物進行PCR 5.5.2 cDNA差示分析法克隆基因 前提：利用兩套cDNA：tester和driver，其中tester中含有少數(shù)dirver中不具有的cDNA即差異基因，除此之外，二者完全相同。 原理1：利用差減雜交，去除相同的部分 原理

11、2：利用增加接頭的方法，特異指示tester， 原理3：利用PCR的指數(shù)擴增，篩選差異基因 cDNA差示分析法克隆基因-RDA RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板，而以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。 因為試驗對象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差示分析前均經(jīng)一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation），保證絕大部分遺傳信息能被擴增。 每次T減D反應(yīng)中兩者物質(zhì)的量比就要求達到1：100或更高，經(jīng)過2-3次重復(fù)，T群體非特異性序列幾乎沒有偶然逃脫的

12、可能性。 5.3.3 Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)（了解） 說明：gateway并不是上述克隆基因的技術(shù)，而只是一種大規(guī)模將目的基因從克隆載體轉(zhuǎn)向表達載體的方法 兩步完成： TOPO反應(yīng)：PCR產(chǎn)物連入Entry載體 LR反應(yīng)：PCR產(chǎn)物從Entry載體重組入表達載體 5.5.4基因的圖位克隆 （map-based cloning or Positional cloning ） 根據(jù)遺傳連鎖分析和染色體步移法，將基因定位到染色體的一個具體位置上，通過篩選基因組文庫來克隆基因。 定位克隆的核心是連鎖分析技術(shù) 連鎖分析即通過基因與基因之間的重組系數(shù)來估計這兩者之間的距離,若某種性狀的基因與另外一個

13、基因在子代不分離,即有連鎖在一起的趨勢。根據(jù)已知基因的染色體位置來判斷未知的連鎖基因的染色體位置。 但是已知的基因與未知基因存在連鎖關(guān)系的并不多,所以連鎖分析對克隆大多數(shù)基因存在著一定的困難。 RFLP等分子標(biāo)記的出現(xiàn)使多態(tài)性基因標(biāo)記存在于整個基因組內(nèi),解決了連鎖分析中難以克服的困難。 尋找連鎖基因就轉(zhuǎn)變成了尋找連鎖標(biāo)記。 定位克隆的前提條件 1、建立相應(yīng)的文庫， 例如BAC、YAC庫。 2、要有合適的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記做篩庫的探針。 基因定位克隆步驟（map-based cloning） (用于分離其編碼產(chǎn)物未知的基因，理論上任何一個有突變的基因都可以通過這種方法克隆出來) （1）

14、根據(jù)突變通過家系分析等將基因定位在染色體上，并在目的基因兩側(cè)確定一對緊密連鎖的分子標(biāo)記（RFLP等）； （2）利用這對分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移(chromosome walking) 技術(shù)或者染色體顯微切割技術(shù)將位于這兩個分子標(biāo)記之間的含有目的基因的基因組片段克隆并分離出來； （3）確定含有目的基因的染色體片斷，也就是再進一步做出更精細的染色體圖譜； （4）最后在這些片段中進一步篩選目的基因，并作突變檢測驗證和功能分析（一般是通過遺傳互補完成） 染色體步移法圖示 Chromosome walking 染色體步移的起點是具有一個與待分離的目的基因盡可能靠近的已經(jīng)鑒定的分子標(biāo)記。這種標(biāo)記可以

15、是RFLP，也可以是已知的基因克隆。 先構(gòu)建起點RFLP標(biāo)記克隆的限制圖，并把其中最靠近目的基因的限制片段亞克隆出來。此限制片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針，從基因組文庫中篩選與起點克隆具有重疊序列的新克隆（稱之為一步克?。Ｖ貜?fù)進行上述的各個步驟。構(gòu)建一步克隆的限制圖，亞克隆其中最靠近目的基因的限制片段，該片段經(jīng)放射性同位素標(biāo)記之后，用作分子雜交探針從基因組文庫中篩選與一步克隆具有重復(fù)序列的新克?。ǚQ之為二步克隆）。如此重復(fù)進行多次，每得到一個新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后獲得了目的基因的克隆。由于這種技術(shù)是通過逐一克隆來自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因