化學(xué)小分子探針在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

化學(xué)小分子探針在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用 仇文衛(wèi)，湯杰華東師范大學(xué)化學(xué)系、藥物化學(xué)研究所當(dāng)今創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)越來越依賴于靶點的發(fā)現(xiàn)以及靶點與活性化合物作用模式的確定，化學(xué)小分子探針在這兩方面的特出優(yōu)越性使其成為藥物化學(xué)的研究熱點。1、 創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)、靶點與化學(xué)小分子探針藥物可以挽救生命、治療疾病、改善健康狀況、緩解痛苦和各種不適，因此，可以說藥物改變著我們的生活，也影響著整個世界。然而，目前開發(fā)新藥的費用平均每個高達數(shù)億美元，盡管投入如此之高，從研發(fā)到上市仍約需10-12年之久（圖1）。因此新藥研發(fā)迫切需要新技術(shù)、新理論，以提高效率、縮短周期。圖1. 新藥研發(fā)過程現(xiàn)代藥物的發(fā)現(xiàn)過程主要包括靶點(target)的識別、先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)優(yōu)化、臨床前及臨床試驗等階段，其中正確的靶點識別是影響整個過程的關(guān)鍵步驟之一。靶點也稱為受體（receptor），是指與藥物分子在體內(nèi)相互作用的功能性大分子，通常是某種蛋白質(zhì)（絕大部分靶點是蛋白質(zhì)）、核酸、離子通道或DNA等。藥物分子在體內(nèi)作用于靶點的特定部位，形成復(fù)合物，從而誘發(fā)生物化學(xué)及生理學(xué)上的變化，產(chǎn)生藥物效應(yīng)，達到治療疾病的目的。若能發(fā)現(xiàn)這些靶點，就可以在此基礎(chǔ)上建立相應(yīng)的篩選模型，對活性化合物進行高效率的活性評價。從而促進先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化的進程。可見，現(xiàn)今藥物的發(fā)現(xiàn)已越來越依賴于藥物靶點的發(fā)現(xiàn)。那么如何解決藥物靶點的發(fā)現(xiàn)問題呢？雖然，生命科學(xué)領(lǐng)域的研究近年來取得了巨大成就， 2001年人類基因組工程的完成更是一個里程碑式的進步。然而，何種蛋白質(zhì)是針對某種疾病的小分子藥物的靶點，在目前基因水平上的生物技術(shù)仍然無法解決。隨著后基因時代的到來，人們逐漸認識到蛋白質(zhì)才是生理功能的執(zhí)行者，也是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。這其中有可能蘊藏著開發(fā)疾病診斷方法和新藥的“鑰匙”，在基因組學(xué)基礎(chǔ)上開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究將有可能導(dǎo)致藥物開發(fā)方面的實質(zhì)性突破。因此針對藥物發(fā)現(xiàn)的技術(shù)重心已經(jīng)由基因組轉(zhuǎn)向了蛋白質(zhì)組。利用化學(xué)小分子的多樣性，選擇適當(dāng)?shù)幕钚孕》肿?，設(shè)計合成能夠高選擇性地探測蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)以及與活性小分子作用模式的探針化學(xué)小分子探針，可以為重大疾病的診斷和防治提供新的標記物、新的藥物作用靶點和新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，從而為創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。在藥物發(fā)現(xiàn)過程中，化學(xué)小分子探針主要有以下幾個方面的作用（圖2）：1. 針對靶點已知的有藥理活性的化合物，可以進行以下三個方面的研究：(1)了解藥物分子與靶點作用部位的結(jié)構(gòu)信息，為進一步的結(jié)構(gòu)改造提供幫助；(2)利用探針分子研究靶點蛋白在生理與病理狀態(tài)下的分布情況，深入研究蛋白質(zhì)的功能；(3)利用探針分子進行細胞或體內(nèi)的標記實驗，可能會發(fā)現(xiàn)一些與活性化合物有交叉作用的靶點蛋白，從而為已知的小分子藥物可能產(chǎn)生的毒副作用提供預(yù)測。2. 對于體內(nèi)作用靶點未知，有藥理活性的化合物，特別是來自天然產(chǎn)物的活性化合物，可以將其設(shè)計成探針分子，通過對細胞或動物的標記實驗來發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的作用靶點，建立新靶點的篩選模型，為先導(dǎo)物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化服務(wù)。圖2. 化學(xué)小分子探針在藥物靶點鑒別及靶點蛋白活性位點結(jié)構(gòu)信息研究中的作用示意圖2. 化學(xué)小分子探針的設(shè)計探針分子一般是以其母體化合物（最初的活性化合物）為基礎(chǔ)，根據(jù)初步的構(gòu)效關(guān)系設(shè)計合成的。設(shè)計的探針分子應(yīng)具有適當(dāng)?shù)幕钚?，與靶點的作用機制應(yīng)與母體化合物保持一致，在不影響其活性的條件下，選擇在活性分子的適宜位置引入各個功能部位?；钚曰衔锱c靶點的作用方式主要有兩種：一是活性化合物中含有某些反應(yīng)基團，可以與靶點蛋白的活性部位發(fā)生反應(yīng)形成共價鍵，因此這種結(jié)合非常穩(wěn)定，是不可逆的；另一種是活性化合物與靶點蛋白通過離子鍵、偶極-偶極相互作用、范德華力、氫鍵等分子間引力相互吸引，形成復(fù)合物，這種作用相對較弱、不穩(wěn)定，是可逆的。2.1 ABPP及PAL-ABPP化學(xué)小分子探針及其功能部位針對能與靶點蛋白形成共價作用的活性化合物設(shè)計的探針分子一般包括四個功能部位：結(jié)合基團(binding group, BG)，反應(yīng)基團(reactive group, RG)、連接部位(linker unit)、報告基團(reporter group)通常也稱標簽(tag)。由于此類探針分子主要用于包括靶點發(fā)現(xiàn)在內(nèi)的蛋白質(zhì)功能的研究，是一種活性基于蛋白譜技術(shù)（activity-based protein profiling, ABPP）的探針分子，因此人們將這種探針分子稱為ABPP探針分子(圖3 A)。圖3. ABPP及PAL-ABPP探針分子標記靶點蛋白針對不能與靶點形成共價鍵，只能通過離子鍵、偶極-偶極相互作用、范德華力、氫鍵等分子間引力形成復(fù)合物，這種作用相對較弱、不穩(wěn)定，是可逆的，因此就需要引入光親和標記基團(photoaffinity labeling group, PAL)，其作用類似于反應(yīng)基團。在探針分子與靶點蛋白形成復(fù)合物后經(jīng)紫外光照射，光親和標記基團分解產(chǎn)生很活潑的反應(yīng)中間體卡賓，將探針分子標記(共價修飾)在靶點蛋白的活性部位，這種探針分子可稱為PAL-ABPP探針分子，也包括四個功能部位：結(jié)合基團、光親和標記基團、鏈接部位、報告基團(圖3 B)。2.2 結(jié)合基團結(jié)合基團(BG)是探針分子最重要的部分，理想情況下它必須將探針分子特異性的導(dǎo)向處于功能狀態(tài)下的靶點蛋白的活性位點，使探針分子與靶點作用，而不與環(huán)境中的其他生物分子作用。2.3 反應(yīng)基團反應(yīng)基團(RG)的作用是在探針分子進入靶點蛋白活性中心后，通過反應(yīng)將探針分子共價修飾在靶點蛋白的活性中心，使探針分子與蛋白質(zhì)的牢固連接。2.4 光親和標記基團光親和標記基團可以在紫外光照射下將探針分子共價修飾在靶點蛋白上。通常被引入的光親和基團包括苯基疊氮類(phenyl azides)、三氟甲基苯基雙吖丙啶類(trifluoro methylphenyl diazirine)、二苯甲酮類(benzophenone)等(圖4)。圖4. 各種光親和標記基團的標記反應(yīng)三者之中，三氟甲基苯基雙吖丙啶是最接近理想的光親和基團。2.6 連接部位連接部位是連接結(jié)合基團、反應(yīng)基團與報告基團的一段柔性的鏈狀結(jié)構(gòu)，它有以下兩個方面的作用：在活性基團與報告基團間制造足夠的空間，以避免探針分子立體結(jié)構(gòu)的擁擠而保持分子活性及提高標記的效率；鏈接基團可以是一段直鏈烷烴鏈或多聚乙二醇鏈，前者有利于提高探針分子的疏水性而有利于其透過細胞膜，后者對于疏水性的探針分子來說可以增強其水溶性。2.7 報告基團報告基團(Tag)的作用是方便人們簡單快速的識別或純化被標記的蛋白。最常用的報告基團有熒光基團(fluorescence group)及生物素(Biotin)等。熒光素如Rhodamine、FAM、FITC、BODIPY、Cy3、Cy5等具有靈敏性高的特點，同時可以利用現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)定量檢測標記蛋白。生物素(biotin)由于其與Avidin蛋白有很強的特異性結(jié)合能力(1015M-1)，因此可以富集、純化或識別被標記蛋白，Biotin與Avidin的復(fù)合物通常可使用鹽酸胍溶液(guanidine-HCl)、SDS溶液、Biotin溶液等使其解析。圖5. 生物素(biotin)富集、純化、識別被標記的蛋白及肽片段3. “點擊化學(xué)”（Click Chemistry）在化學(xué)小分子探針合成中的應(yīng)用Click chemistry(簡稱CC)，又稱點擊化學(xué)，是最近幾年發(fā)展起來的一種化學(xué)合成新技術(shù)，click是點擊鼠標的聲音，意思是這個反應(yīng)非常容易而且可靠，就像點擊鼠標一樣。2001年，美國Scripps研究所諾貝爾獎獲得者Sharpless等提出CC這一概念，是指具有以下特征的化學(xué)反應(yīng)：反應(yīng)原料易得，反應(yīng)非?？煽浚瑢ρ鯕?、水不敏感，產(chǎn)物立體選擇性好、產(chǎn)率高，反應(yīng)后處理及產(chǎn)物分離簡單方便，一般不需要柱層析，反應(yīng)副產(chǎn)物對環(huán)境友好。其中最重要的“click”反應(yīng)是指炔基在Cu(I)催化下與疊氮基形成穩(wěn)定的1, 2, 3-三氮唑化合物(也稱Huisgen 1, 3-偶極環(huán)加成)的反應(yīng)，在組合化學(xué)、靶點導(dǎo)向的活性小分子合成及生物偶聯(lián)技術(shù)等方面有著較好的應(yīng)用。CC技術(shù)的出現(xiàn)也極大地促進了化學(xué)小分子探針技術(shù)的發(fā)展。直到最近ABPP探針分子標記實驗一直是在細胞或組織勻漿液中進行的(這些體外的蛋白組樣品只能大致的反應(yīng)蛋白質(zhì)在活細胞或組織中的功能狀態(tài))，一個主要的原因是報告基團體積很大使得小分子探針的分子量通常在7001000Da，限制了探針分子的吸收、分布，甚至可能改變探針分子的作用模式。美國Scripps研究所Cravatt等最早將CC與ABPP技術(shù)結(jié)合起來，發(fā)展了CC-ABPP策略：靶點蛋白首先被探針分子標記 (PS-N3)，然后在Cu(I)催化下與標簽分子發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)生成三氮唑分子將標簽連接到探針分子上(圖6)，克服了ABPP探針分子的上述缺點。CC-ABPP探針分子設(shè)計包括結(jié)合基團、反應(yīng)基團、連接部位、潛在的報告基團(一般為體積很小的疊氮基，在探針分子標記了靶標蛋白后，可與帶有炔基的報告基團發(fā)生“click”反應(yīng)將報告基團引入探針分子；或也可為炔基，可與帶有疊氮基的報告基團發(fā)生“click”反應(yīng)將報告基團引入探針分子)。CC-ABPP策略與ABPP策略的主要區(qū)別在于其報告基團是在探針分子標記了靶標蛋白后，通過“click”反應(yīng)引入的，這樣就避免了ABPP實驗中，報告基團體積過大所造成的一些不足。同理對于與靶點蛋白非共價作用的活性化合物，Cravatt等設(shè)計了PAL-CC-ABPP探針分子，其功能部位包括結(jié)合基團、光親和標記基團、連接部位、潛在的報告基團。圖6 CC-ABPP策略PS-N3是一個活性導(dǎo)向的多靶點探針分子，它可用于對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTO 1-1)、醛脫氫酶(ALDH-1)、巴豆酸酶(ECH-1)等的標記。Cravatt等運用CC-ABPP策略，將PS-N3與COS細胞孵育，細胞勻漿后加入炔基羅丹明（）在Cu(I)催化下發(fā)生“click”反應(yīng)，將熒光素羅丹明引入到探針分子中方便標記后的檢測。結(jié)果顯示PS-N3能夠在原位(in situ)標記GSTO 1-1。它們甚至將PS-N3注射到老鼠體內(nèi)，處死老鼠后取其心臟組織勻漿后加入炔基羅丹明進行“click”反應(yīng)，結(jié)果顯示探針分子能夠在動物體內(nèi)標記ECH-1(圖7)。小分子探針PS-N3很容易被細胞吸收，并在原位共價標記靶標蛋白，Cravatt等將其與乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)孵育后細胞勻漿，加入炔基羅丹明進行“click”反應(yīng)。結(jié)果顯示運用CC-ABPP策略針對MDA-MB-231標記到的一些靶點蛋白，是以前運用ABPP策略在體外(in vitro)標記從來沒有發(fā)現(xiàn)的，這些靶標蛋白可能成為治療此類疾病的一些新靶點。圖7. 運用CC-ABPP探針分子在細胞內(nèi)與動物體內(nèi)標記靶點蛋白5. 回顧與展望化學(xué)小分子探針在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，特別是在功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中扮演著越來越重要的角色。運用化學(xué)小分子探針標記技術(shù)使得大量與疾病相關(guān)的靶點被發(fā)現(xiàn)，活性小分子與其靶標蛋白之間的作用模式被確定，為藥物的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展提供必需的重要信息，是