細(xì)菌基因工程

第十六章細(xì)菌基因工程,第一節(jié)細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)第二節(jié)細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)第三節(jié)細(xì)菌基因工程的應(yīng)用,第一節(jié)細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì),一、基因工程的發(fā)展簡(jiǎn)史細(xì)菌是單細(xì)胞、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的原核微生物；它的物種和代謝類型多樣對(duì)環(huán)境因子敏感；最顯著的特征是生長(zhǎng)速度快，便于大規(guī)模培養(yǎng)，易于進(jìn)行遺傳操作。1973年，波依爾（Boyer）和科恩（Cohen）首次完成外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)。幾年后，第一個(gè)基因工程產(chǎn)品利用構(gòu)件的基因工程菌生產(chǎn)人胰島素獲得成功，自此進(jìn)入生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)時(shí)代。細(xì)菌的遺傳改造也是基因工程中最早，研究最廣泛取得實(shí)際應(yīng)用成果最多的領(lǐng)域。,1.細(xì)菌工程菌與人類藥物生產(chǎn)細(xì)菌是生產(chǎn)蛋白藥物的最好生物反應(yīng)器，利用細(xì)菌基因重組技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)：對(duì)化學(xué)方法難以合成的中間體進(jìn)行合成，從而生產(chǎn)活力更強(qiáng)的衍生物；是微生物產(chǎn)生新的合成途徑，從而獲得新的代謝產(chǎn)物；利用微生物產(chǎn)生的酶對(duì)藥物進(jìn)行化學(xué)修飾；生產(chǎn)天然稀有的醫(yī)用活性多肽或蛋白質(zhì)。,二、細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀,未來(lái)市場(chǎng)前景廣闊的藥品將集中在單克隆抗體、反義藥物、基因治療藥物、可溶性蛋白質(zhì)類藥物和疫苗5類中，其中單抗最引人注目。,細(xì)菌工程菌與環(huán)境保護(hù)利用環(huán)境微生物基因工程技術(shù)治理環(huán)境污染和遏制生態(tài)惡化趨勢(shì)，促進(jìn)自然資源的可持續(xù)利用，是一條最安全和最徹底消除污染的有效途徑。它充分利用環(huán)境微生物的生物凈化、生物轉(zhuǎn)化和生物催化等特性的功能基因，構(gòu)建基因工程菌進(jìn)行污染治理、清潔生產(chǎn)和可再生資源利用。與化學(xué)、物理方法相比，其效率高、成本低、反應(yīng)條件溫和無(wú)二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可加強(qiáng)自然環(huán)境的自凈化能力。美國(guó)科學(xué)家已用基因工程將帶不同降解能力的質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入同一細(xì)菌中，從而培育出能同時(shí)降解4種烴類的“超級(jí)工程菌”。,細(xì)菌工程菌與食品、飼料及其他工業(yè)理論上所有發(fā)酵食品與食品配料生產(chǎn)菌都可以進(jìn)行菌種改良，但由于氨基酸、有機(jī)酸、維生素、色素、香料等均屬于微生物代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)菌的遺傳改造較為復(fù)雜，目前尚處于研究階段。但也有少數(shù)獲得了成功。相對(duì)而言，酶制劑的合成所涉及的基因較為簡(jiǎn)單，適合利用基因工程進(jìn)行改良。,除食品用酶制劑外，細(xì)菌基因工程菌也已成功應(yīng)用于生產(chǎn)其他不同目的的酶，如將葡萄糖轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶；應(yīng)用于PCR的耐熱DNA聚合酶；用于生產(chǎn)青霉素母核的青霉素?；傅取，F(xiàn)在的細(xì)菌基因工程完全可以做到：將次級(jí)反應(yīng)轉(zhuǎn)換到主要代謝途徑中；優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量及其產(chǎn)量；改變初始代謝途徑使之能夠利用更廉價(jià)的原料，或者得到以前未知的新產(chǎn)物；利用酶的異構(gòu)體獲得新的手性分子。,基因工程菌與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)近年來(lái)基因工程的研究為農(nóng)業(yè)微生物遺傳改良提供了有效的手段，成為生命科學(xué)領(lǐng)域中最活躍，最具創(chuàng)新的前沿之一。在農(nóng)業(yè)上，世界各國(guó)獲準(zhǔn)進(jìn)入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工程菌釋放總數(shù)的1.15%。其中美國(guó)構(gòu)建了整合外源dctABD基因（提高固氮能力）的轉(zhuǎn)基因重組苜蓿是世界首例通過安全性評(píng)價(jià)進(jìn)入有限商品化的工程根瘤菌。20世紀(jì)90年代以來(lái)，以蘇金云芽胞桿菌為龍頭的微生物工程殺蟲劑迅速發(fā)展。由我國(guó)學(xué)者研制的轉(zhuǎn)ntrC-nifA基因固氮斯氏假單胞菌AC1541和蘇云金芽孢桿菌高產(chǎn)廣譜工程菌均已通過審批進(jìn)入安全性評(píng)價(jià)的商品化生產(chǎn)階段。,隨著生物科學(xué)的進(jìn)展，細(xì)菌基因工程研究的范圍也進(jìn)一步拓寬。細(xì)菌基因工程的重點(diǎn)將會(huì)放在細(xì)菌資源的發(fā)掘和利用上，即從現(xiàn)存豐富的細(xì)菌資源中鑒定分離具有殺菌、殺蟲、防病、除草、固氮、促生、抗逆、降解污染物、促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等各種功能的新基因，以及難培養(yǎng)和極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)利用。要注意革新細(xì)菌基因工程的生產(chǎn)工藝，在積極促進(jìn)重組技術(shù)發(fā)展的同時(shí)要高度重視和預(yù)防轉(zhuǎn)基因細(xì)菌對(duì)健康和環(huán)境可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。,三、細(xì)菌基因工程菌的發(fā)展趨勢(shì)及前景展望,第二節(jié)細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng),一、細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)由3部分組成：外源基因、表達(dá)載體、宿主細(xì)菌。外源基因的表達(dá)水平不僅與基因的來(lái)源、基因的性質(zhì)以及載體有關(guān)，還取決于宿主細(xì)胞。要使克隆的外源基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，首先要構(gòu)筑專門的表達(dá)載體（expressionvector），用來(lái)控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及克隆基因產(chǎn)物的分泌等。,大腸桿菌是目前研究最深入，使用最廣的基因工程宿主菌。在基因工程領(lǐng)域里，大腸桿菌主要做為外源蛋白超量表達(dá)的平臺(tái)，其主要目的是對(duì)不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行體外超量表達(dá)從而可以將目的蛋白用于不同的下游領(lǐng)域，如制備基因工程疫苗，蛋白質(zhì)組學(xué)研究。,二、表達(dá)載體構(gòu)建原則表達(dá)載體實(shí)際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上裝載了用于表達(dá)的一些元件（cassette），當(dāng)外源基因插入到合適位點(diǎn)后，在宿主菌種就可以啟動(dòng)表達(dá)。目前在大腸桿菌和酵母中使用的表達(dá)載體種類繁多，已形成了成熟的表達(dá)系統(tǒng)。但在其他細(xì)菌中通常是將目的基因與表達(dá)元件（主要是相關(guān)的啟動(dòng)子）連接，在裝載在特定的克隆載體上，然后導(dǎo)入宿主菌種表達(dá)。,因此表達(dá)載體的構(gòu)建主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用。對(duì)于克隆載體，只要滿足在宿主菌中復(fù)制和選擇要求的載體，都可用作克隆載體。大腸桿菌以外的細(xì)菌中應(yīng)用的克隆載體一般是穿梭載體，都含有大腸桿菌克隆載體的序列，便于在大腸桿菌中擴(kuò)增和制備。克隆載體可以是質(zhì)粒載體，也可以是將外源基因整合到染色體上的整合基因載體。,啟動(dòng)子的選擇,通過基因工程手段表達(dá)外源基因的目的大致有兩種：其一是超量表達(dá)，以達(dá)到最大限度的活的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。其二是使某個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)，使宿主菌表現(xiàn)出特殊的性狀，或啟動(dòng)其他產(chǎn)物的大量合成。,轉(zhuǎn)錄的有效性為保證外源基因轉(zhuǎn)錄的有效性，在表達(dá)載體上應(yīng)設(shè)法除去衰減序列或插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列以免轉(zhuǎn)錄的提前終止，保證mRNA有效的延伸和終止。也可以在終止密碼子后增加終止子序列，是轉(zhuǎn)錄正確、有效終止。,翻譯起始的有效性,翻譯起始是多種成分包括mRNA、16SrRNAfMet-tRNA，核糖體S1蛋白，蛋白合成起始因子之間協(xié)同作用的過程。要使翻譯起始率最高要滿足以下條件：選用最佳起始密碼子AUG；與SD序列相似或與（5AGGAGG3）序列完全相同；除SD序列外，處于起始密碼前的兩個(gè)核氨酸應(yīng)該是A和U；在不改變蛋白質(zhì)功能的前提下，如果在起始密碼AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻譯效率提高；在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。,翻譯的有效終止,在基因工程中，一般都采用UAA或一連串的終止密碼來(lái)有效終止原核細(xì)胞的翻譯。,三、外源基因表達(dá)的方式,外源基因以融合蛋白形式表達(dá)融合表達(dá)是指目的基因與編碼具有特殊活性的多肽和蛋白質(zhì)的基因融合，構(gòu)建成一融合蛋白基因。構(gòu)建可分泌蛋白，分泌到胞外培養(yǎng)基中通常位于蛋白質(zhì)N段的稱為信號(hào)肽的一段氨基酸序列會(huì)幫助蛋白通過細(xì)胞膜。通過基因操作可以在外源蛋白的N端添加編碼信號(hào)肽的DNA序列形成一個(gè)分泌蛋白。,外源蛋白在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá)包涵體是致密的不溶性復(fù)合物含有大部分的表達(dá)蛋白，可以抵抗宿主細(xì)胞中蛋白酶的降解，也便于純化。外源基因在細(xì)胞表面的表達(dá)（表面展示技術(shù)）微生物細(xì)胞表面展示（cellsurfacedisplay）技術(shù)是把目的蛋白基因序列（外源蛋白）與特定的載體蛋白基因序列（定位序列）融合后導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞從而使目的蛋白表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面。,四、常見細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng),以下主要介紹幾種常見的細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)。革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體如pAV10等都是低拷貝數(shù)、廣宿主質(zhì)粒Prk290的多克隆位點(diǎn)中插入來(lái)源于轉(zhuǎn)座子Tn5末端反向重復(fù)序列的一段70bpDNA而構(gòu)建的。（如圖16-1）。來(lái)源于Tn5的DNA克隆片斷包含兩個(gè)獨(dú)立而重疊的啟動(dòng)子，每個(gè)啟動(dòng)子分別負(fù)責(zé)一個(gè)Tn5的轉(zhuǎn)錄。,芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng),枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌、無(wú)莢膜、能運(yùn)動(dòng)的桿狀細(xì)菌，無(wú)致病性，對(duì)人畜無(wú)害。具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)便。,下面介紹兩種應(yīng)用于枯草芽孢桿菌的載體,穿梭載體作為穿梭載體（shuttlevector）應(yīng)同時(shí)具有大腸桿菌載體和枯草芽孢桿菌載體的復(fù)制起點(diǎn)例如pDG148-Stu。（圖16-2）其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：具有乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因lacI及其調(diào)控序列；具有一個(gè)雜合啟動(dòng)子；3個(gè)抗性基因作為篩選標(biāo)記。,整合載體能將目的基因整合到宿主的基因組中的載體成為整合載體（integrationvector），一般通過同源重組或轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座特性實(shí)現(xiàn)外源基因整合。pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到-淀粉酶基因內(nèi)部。該載體的基本骨架是大腸桿菌的克隆載體和用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的紅霉素抗性選擇標(biāo)記基因。,微生物細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng),微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)的構(gòu)成包括載體蛋白、目的蛋白和宿主菌株。位于細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)都可用于細(xì)胞表面展示，常見的載體蛋白有大腸桿菌的外膜蛋白（OmpA和OmpC）和與肽聚糖相關(guān)的質(zhì)蛋白（PAL）等。在大多數(shù)細(xì)菌表面融合蛋白中，目的蛋白位于融合蛋白的N或C端，有時(shí)目的蛋白的斷片段也可以在融合蛋白的中間表達(dá)（圖16-3）。,微生物細(xì)胞的表面展示技術(shù)有廣泛的用途，可開發(fā)生物制品如活疫苗、細(xì)胞催化劑、細(xì)胞吸附劑、生物傳感器等。但這一領(lǐng)域里仍存在許多問題有待解決如空間阻礙、多亞基蛋白表達(dá)、多種外源蛋白的同時(shí)表達(dá)等問題。,第三節(jié)細(xì)菌基因工程的應(yīng)用,基因工程的實(shí)踐主要有3種形式：其一：是改造細(xì)菌使之性狀得到遺傳改良；其二：是制作生物反應(yīng)器，利用細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)某種物質(zhì)；其三：還有一類是基因工程改造的是細(xì)菌本身，但需要的是其產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。下面將簡(jiǎn)單介紹一些重要的基因工程細(xì)菌：,一、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基因工程細(xì)菌,微生物基因工程農(nóng)藥目前微生物農(nóng)藥主要有微生物殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等。農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的殺蟲基因有3大類，一類是從細(xì)菌中分離出來(lái)的細(xì)菌殺蟲劑如蘇云金芽孢桿菌,殺蟲晶體蛋白ICP基因；另一類是從植物中分離出來(lái)的植物抗蟲基因，如豇豆胰蛋白酶抑制劑因；此外還有還有其他來(lái)源的蝎毒基因aaIT，桿狀病毒基因幾丁質(zhì)酶基因等。重組微生物殺蟲劑蘇云金芽孢桿菌基因工程及應(yīng)用蘇云金芽孢桿菌是目前國(guó)內(nèi)外產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑。Bt在其生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生不同類型的殺蟲晶體蛋白，主要作用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆蟲幼蟲，而對(duì)人和哺乳動(dòng)物非常安全。,近年來(lái)，從Bt中命名的ICP基因已有50大類，250種，其中crylAa、crylAb、crylAc3個(gè)基因是殺蟲毒力最高的種類，主要存在于庫(kù)斯塔克亞種（subsp,kurstaki）中。通過基因工程技術(shù)改造的Bt主要是為了增強(qiáng)殺毒力、拓寬殺毒范圍、延長(zhǎng)特效期、克服可能出現(xiàn)的昆蟲抗性等。,蘇云金芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建涉及以下方面：首先確定載體的類型，主要是質(zhì)粒載體，同時(shí)為了復(fù)制的穩(wěn)定，一般用Bt自身質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)作為載體的復(fù)制單元，如穿梭載體pHT304。為了保證基因工程菌環(huán)境釋放的安全性，要求將載體中的非Bt來(lái)源的DNA片段去掉。為此，采用了Bt轉(zhuǎn)座子中的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，在攜帶重組酶基因的輔助質(zhì)粒幫助下，質(zhì)粒載體內(nèi)部發(fā)生重組，形成兩個(gè)質(zhì)粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質(zhì)粒由于不能復(fù)制而丟失，保留來(lái)自Bt的DNA片段。這種載體叫解離載體。（見圖16-4）,農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的遺傳操作農(nóng)用抗生素是由抗生菌發(fā)酵所產(chǎn)生的具有農(nóng)藥功能的次級(jí)代謝產(chǎn)物，它是由明確分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)。阿維菌素是目前世界上有關(guān)生物合成基因簇研究的最深的抗生素之一。殺蟲抗病重組微生物許多細(xì)菌具有殺死或抑制植物病原菌的作用或具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用或在植物的頁(yè)面或根部具有優(yōu)勢(shì)定植能力，將殺蟲基因?qū)脒@些細(xì)菌可以獲得改良的殺蟲細(xì)菌如熒光假單胞菌。,其他殺蟲抗病微生物1）生物囊殺蟲劑將Bt毒素蛋白基因轉(zhuǎn)入到熒光假單胞菌中，使其高效表達(dá)并形成伴胞晶體發(fā)酵后用化學(xué)或物理方法將菌體殺死但不破壞伴胞晶體而且菌體外型保持完整，從而形成一種生物囊制劑。（圖16-5）2）基因工程抗病菌放射農(nóng)桿菌K-84可以產(chǎn)生農(nóng)桿菌素（agrocin）84，其組分為腺嘌呤脫氧阿拉伯糖苷氨基磷酸鹽，可有效防治根癌農(nóng)桿菌引起的植物根癌病。,3）殺蟲抗病工程菌將具有抑制歐文氏菌病原基因表達(dá)的aii基因（AHL-內(nèi)酯酶）通過S-層蛋白為載體在Bt細(xì)胞表面表達(dá)，構(gòu)建出殺蟲抗病工程菌，在魔芋田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)軟腐病菌的良好抗病效果。,微生物肥料主要有以下幾類：固氮菌；解磷菌；解鉀菌；植物根際促生菌（PGPR）；VA菌根真菌；腐熟劑；光合細(xì)菌；復(fù)合菌肥。,對(duì)根瘤菌進(jìn)行的基因工程研究集中在進(jìn)一步提高固氮效率和解決“老區(qū)問題”。老區(qū)問題指的是根瘤菌劑接種在從未種植過豆科植物的新區(qū)時(shí)增產(chǎn)效果顯著，而多年種植的老區(qū)卻不穩(wěn)定。解決老區(qū)問題的方法主要有使接種菌產(chǎn)生能夠抑制土著菌的抗生素以及導(dǎo)入競(jìng)爭(zhēng)瘤相關(guān)基因增加菌劑的結(jié)瘤能力等。,提高根瘤菌固氮能力的途徑主要有：,提高根瘤菌固氮相關(guān)的固氮酶、吸氫酶等基因的表達(dá)水平。降低土壤中銨離子對(duì)根瘤菌固氮能力的抑制作用。增加宿主對(duì)根瘤菌碳源和氮源的供應(yīng)。,二、食品和工業(yè)基因工程菌乳酸菌基因工程菌乳酸菌是一類以發(fā)酵為基本特征的革蘭氏陽(yáng)性菌群，包括乳酸桿菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、鏈球菌（Streptococcus）片球菌（Pediococcus）和明串球菌（Leuconostoc）5個(gè)菌屬。乳酸菌有以下共性：都能在較低PH值及厭氧條件下良好生長(zhǎng)；并能利用碳水化合物生產(chǎn)大量的乳酸；幾乎所有的乳酸菌都是非致病性的。,乳酸菌基因工程的改良主要包括3方面：,提高生產(chǎn)菌在食品發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性；改善發(fā)酵食品的品質(zhì)；縮短生產(chǎn)周期。,生產(chǎn)食品添加劑的基因工程菌氨基酸工程菌現(xiàn)在主要利用DNA的重組技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)工程菌，相對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)其優(yōu)點(diǎn)是：能特異性的高效表達(dá)氨基酸生物合成途徑中的限速步驟控制基因；能將氨基酸的生物合成控制在細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)階段；能將棒桿菌有效的氨基酸合成和分泌系統(tǒng)移植到易于控制培養(yǎng)且生長(zhǎng)迅速的其他細(xì)菌如（大腸桿菌）中。,氨基酸工程菌的構(gòu)建主要集中在以下3方面：借助于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將氨基酸生物合成途徑中的限速酶基因?qū)肷a(chǎn)菌中增加其表達(dá)量。強(qiáng)化表達(dá)氨基酸輸出系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，或者降低某些基因產(chǎn)物的表達(dá)效率，最大限度的接觸氨基酸及其生物合成中間產(chǎn)物對(duì)其生物合成途徑可能造成的反饋抑制。將一種完整的氨基酸合成操縱子導(dǎo)入另一種氨基酸的生產(chǎn)菌中，構(gòu)建能同時(shí)合成2種甚至多種氨基酸工程菌。與其它革蘭氏陽(yáng)性菌不同，谷氨酸棒桿菌能夠識(shí)別包括革蘭氏陰性菌在內(nèi)的許多原核細(xì)菌的外源基因表達(dá)控件。,1）色氨酸工程菌的構(gòu)建,鄰氨基苯甲酸合成酶是色氨酸合成途徑中的限速酶（圖16-6），在野生型谷氨酸棒桿菌中引入編碼該酶的基因，色氨酸的產(chǎn)量大約提高130%。,2)L-半胱氨酸高產(chǎn)菌的構(gòu)建,由于L-半胱氨酸會(huì)反饋抑制參與催化L-半胱氨酸生物合成的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，因而不能從葡萄糖大量合成L-半胱氨酸。（圖16-7）將大腸桿菌氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列上第256位的蛋氨酸殘基逐一突變?yōu)槠渌?9種氨基酸，并將突變cysE基因轉(zhuǎn)化不降解L-半胱氨酸大腸桿菌，獲得L-半胱氨酸產(chǎn)量高的轉(zhuǎn)化子。為提高成功率，在絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷和L-半胱氨酸非利用型的大腸桿菌中表達(dá)來(lái)自植物擬南芥的不受反饋抑制影響的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，能產(chǎn)生更高水平的L-半胱氨酸。,合成L-抗壞血酸的重組菌L-抗壞血酸的合成從D-葡萄糖開始，包括一步微生物發(fā)酵和一系列的化學(xué)反應(yīng)，最后由2-酮-L-古龍?zhí)撬幔?-KLG）在酸催化作用下轉(zhuǎn)變成L-抗壞血酸。通過遺傳操作能將微生物的不同途徑組合起來(lái)合成2-KLG，進(jìn)而生成L-抗壞血酸。如草生歐文菌能通過幾個(gè)步驟的催化作用，將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成2，5-二酮-L-古龍?zhí)撬幔?，5-DKG）但不能將2，5-DKG進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成2-KLG；,而棒桿菌因?yàn)榫哂?，5-DKG還原酶活性只需要一步酶催化作用就能將2，5-DKG轉(zhuǎn)化成2-KLG。因此，可以從棒桿菌中分離2，5-DKG還原酶基因并到如草生歐文菌中高效表達(dá)，這樣就能利用重組的草生歐文菌直接將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為2，5-DKG，而克隆的2，5-DKG還原酶有能將其轉(zhuǎn)變成L-抗壞血酸的前體2-KLG（圖16-8）。,生產(chǎn)酶制劑的工程菌,生物酶工程主要包括3方面內(nèi)容：利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶；對(duì)酶基因進(jìn)行遺傳修飾；設(shè)計(jì)出新的酶基因。,1）凝乳酶凝乳酶（chymosin）是第一個(gè)應(yīng)用于食品工業(yè)的基因工程酶。它是生產(chǎn)奶酪的必須用酶，最早是從小牛第四胃的胃末種萃取的一種凝乳物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因凝乳酶成分單一,純度高，作用時(shí)間易把握，風(fēng)味與萃取物相同。2）耐熱-淀粉酶和-淀粉酶日本科學(xué)家將耐熱的嗜熱脂肪芽孢桿菌的-淀粉酶基因轉(zhuǎn)到枯草芽孢桿菌中，獲得了高產(chǎn)耐熱的-淀粉酶工程菌。,3）-環(huán)狀糊精葡基轉(zhuǎn)移酶-環(huán)狀糊精可將多種有機(jī)物質(zhì)包埋在分子內(nèi)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。我國(guó)科學(xué)家用染色體整合擴(kuò)增技術(shù)，成功地構(gòu)建了大量表達(dá)-CGT的基因工程菌BS16-7，震蕩試驗(yàn)表明酶活力最高達(dá)8900U/ml,有很好的應(yīng)用潛力。4）其他酶制劑超氧化物歧化酶（SOD）、生產(chǎn)高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶等。酶是食品加工中的重要輔助劑，利用基因工程菌生產(chǎn)有許多優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量高、質(zhì)量均一、穩(wěn)定性佳、價(jià)格低廉等，有很好的發(fā)展前景。,合成靛藍(lán)的工程菌,靛藍(lán)可用于印染棉布和羊毛制品，特別是用來(lái)印染牛仔服。它最初來(lái)自植物，通過化學(xué)合成生產(chǎn)?？茖W(xué)家偶然發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化假單胞菌降解質(zhì)粒NAH7DNA片段后的大腸桿菌能合成靛藍(lán)，應(yīng)大腸桿菌能合成色氨酸酶，將培養(yǎng)基中的色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)檫胚?；NAH7質(zhì)粒編碼的萘雙加氧酶又能將吲哚氧化成對(duì)吲哚-2，3-二氫二醇，后者自動(dòng)脫水、空氣氧化后形成靛藍(lán)。（圖16-9）因此可以利用重組大腸桿菌細(xì)胞制備和成靛藍(lán)的生物反應(yīng)器。,限制性內(nèi)切酶的生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶是分子克隆和核酸分析研究的常用工具。其商品化生產(chǎn)時(shí)將限制性內(nèi)切酶基因克隆到大腸桿菌內(nèi)超量表達(dá)。為避免異源限制性內(nèi)切酶對(duì)宿主DNA的降解作用，可以同時(shí)克隆限制性內(nèi)切酶及其對(duì)應(yīng)的修飾酶，但要求這兩個(gè)基因在染色體上的距離很近（一般在一個(gè)操縱子上）。,三、重組DNA技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)用抗生素,從發(fā)現(xiàn)青霉素至今，人們已從不同的微生物中分離出的抗生素已超過12000種。但重要的醫(yī)用抗生素絕大部分是從革蘭氏陽(yáng)性鏈霉菌（Streptomyces）中分離得到的。重組DNA技術(shù)的應(yīng)用，使人們可以用來(lái)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上獨(dú)一無(wú)二、活性上升而副作用減小的新抗生素；其次，通過遺傳操作也能夠迅速提高產(chǎn)量降低成本。,合成新抗生素某鏈霉菌合成梅德酶素（medermycin），鏈霉菌質(zhì)粒（Pij2303）上帶有天藍(lán)色鏈霉菌染色體DNA的一個(gè)32.5kbDNA片段，將完整的質(zhì)粒和攜帶32.5kbDNA片段的亞克?。≒ij2315）轉(zhuǎn)入鏈霉菌AM-7161時(shí)，能合成相應(yīng)抗生素梅德酶素。（表16-1）利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)新的雜種抗生素，尤其是與聚酮抗生素有關(guān)的研究已成為熱點(diǎn)。,改進(jìn)抗生素生產(chǎn)開發(fā)能有效利用氧的鏈霉菌利用鏈霉菌進(jìn)行大規(guī)模抗生素生產(chǎn)時(shí)常遇到缺氧的問題。科學(xué)家們借鑒好氧微生物用來(lái)抵御缺氧環(huán)境的策略，如好氧菌透明顫菌屬（Vitreoscilla）能合成同源二聚體血紅素蛋白，將該基因克隆入鏈霉菌質(zhì)粒載體，在天藍(lán)色鏈霉菌中利用透明顫菌屬血紅蛋白基因的啟動(dòng)子表達(dá)。從而使細(xì)胞獲得足夠的氧氣進(jìn)行增殖。,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)黃頭孢工程菌大量生產(chǎn)7ACA（7-氨基頭孢酸）,化合物7ACA由頭孢菌素C合成（圖16-10）是許多頭孢烯類抗生素（頭孢菌素）合成的起始物質(zhì)。通過基因重組，將來(lái)自真菌茄病鐮刀菌的D-氨基酸氧化酶基因和來(lái)自缺陷短波假單胞菌的頭孢菌素?；富蜣D(zhuǎn)化能產(chǎn)生頭孢菌素C的產(chǎn)黃頭孢，得到的基因工程菌就能大量合成7ACA（圖16-11、16-12）。,抗生素生產(chǎn)菌的遺傳改良還包括其他方面：。,通過解除抗生素生物合成中的限速步驟來(lái)提高其產(chǎn)量；通過引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因來(lái)提高其產(chǎn)量；通過敲除和破壞次要組分的基因來(lái)消除或減少次要組分來(lái)提高產(chǎn)量,四、環(huán)境微生物基因工程菌的應(yīng)用微生物基因工程技術(shù)是實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢物資源化的首選。它能將有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化為沼氣、酒精、有機(jī)材料或原料、單細(xì)胞蛋白等。還可以改造傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，使生產(chǎn)過程的清潔化、生態(tài)化、或無(wú)廢化。下面介紹幾種常見種類。,修復(fù)重金屬離子污染土壤的基因工程菌微生物對(duì)重金屬的生物富集作用包括表面吸附、固定、吸收等。目前已有研究者利用細(xì)菌表達(dá)金屬硫蛋白MT（metallothionein）提高其固定污染土壤中有利重金屬離子的能力。,含酚廢水危害極大。自然界中存在很多能降解芳烴及其氯代衍生物的土著微生物如苯酚降解菌、苯胺降解菌、萘降解菌等，它們雖然在實(shí)驗(yàn)室條件下能高效降解污染物，但在自然條件下卻不能很好的發(fā)揮作用。因?yàn)檫@類菌株是通過單一地物富集而分離的，自然條件下不具備降解混合污染物的能力。通過基因工程手段能增強(qiáng)或添加菌株的污染物降解能力。許多重要的芳烴及其氯代衍生物降解基因位于大小超過40kb的降解質(zhì)粒上如兒茶酚降解質(zhì)粒等。芳烴及其衍生物降解基因通常連鎖成簇組成操縱子，如兒茶酚降解基因catABCD。,含酚工業(yè)廢水中典型污染物的生物降解技術(shù),造紙廢水包括化學(xué)制漿和化學(xué)漂白兩部分，在制漿過程中，紙漿中殘留的木質(zhì)素與木聚糖形成復(fù)合體緊密地附著在纖維上，影響紙張的白度和強(qiáng)度。生物技術(shù)漂白就是利用微生物酶類如木聚糖酶（xylanase）與漆酶（laccase）的共同作用，降解造成紙漿褐色的木質(zhì)素木聚糖復(fù)合體，是紙漿各種參數(shù)達(dá)標(biāo)。,造紙工業(yè)中木聚糖酶高效表達(dá)工程菌的應(yīng)用,石油產(chǎn)品的微生物脫硫技術(shù),為了減少石油產(chǎn)品中的含硫化合物，降低汽油柴油