微生物 顯微鏡和顯微技術(shù)ppt課件

2顯微鏡和顯微技術(shù),1,2,借助于顯微鏡觀察微生物的方法即顯微技術(shù)，顯微技術(shù)是微生物檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。,3,顯微鏡的種類和原理,顯微觀察樣品的制備,4,一、顯微鏡的種類和原理,(一)、光學(xué)顯微鏡,普通光學(xué)顯微鏡,暗視野顯微鏡,相差顯微鏡,熒光顯微鏡,現(xiàn)在的光學(xué)顯微鏡分辨的最小極限達(dá)0.2m。,5,普通光學(xué)顯微鏡的幾個基本概念,6,7,8,9,10,1、普通光學(xué)顯微鏡,由三部分構(gòu)成照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器；光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便,11,油鏡使用,光鏡使用方法,12,2、暗視野顯微鏡,原理：聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。適用范圍：生活細(xì)菌運(yùn)動性觀察。,13,特點(diǎn):只能看到物體的存在與運(yùn)動,不能辨清其微細(xì)結(jié)構(gòu)。,暗視野顯微鏡的使用,14,基本原理:把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。,3、相差顯微鏡,相差顯微鏡使用,15,微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻形態(tài),適用范圍：對透明的活體進(jìn)行直接觀察,16,4、熒光顯微鏡,原理：熒光素吸收紫外線并放出部分波長較長的可見光，發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體,17,綠色：銅綠假單胞菌黃色：蠟樣芽孢桿菌,綠色：微管紅色：微絲藍(lán)色：核,18,1931年在德國柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成的。用高速電子束代替光束。放大倍數(shù)可達(dá)80萬倍，分辨的最小極限達(dá)0.2納米。,（二）電子顯微鏡,透射電子顯微鏡,掃描電子顯微鏡,19,1、透射電子顯微鏡,目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。用電子束作光源，用電磁場作透鏡。用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍.由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。,20,高爾基體的TEM照片(偽彩色),21,22,2、掃描電子顯微鏡,掃描電子顯微鏡,大腸桿菌掃描電鏡圖,工作原理：電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu),23,掃描電子顯微鏡原理,24,25,3、掃描隧道顯微鏡（STM）,掃描隧道顯微鏡拍攝的7個鈾原子團(tuán),26,27,4原子力顯微鏡,28,29,光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的特點(diǎn)比較,30,（一）光學(xué)顯微鏡制樣,活體觀察,染色,壓滴法,懸滴法,菌絲埋片法,活菌,死菌,美藍(lán)染色,簡單染色,鑒別染色,革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色,二、顯微觀察樣品的制備,31,（1）壓滴法：菌懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，觀察。（2）懸滴法：蓋玻片中央加一小滴菌懸液，翻轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上，觀察。（3）菌絲埋片法：無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，觀察菌絲形態(tài)。,光學(xué)顯微鏡樣品制備活體觀察,特點(diǎn)：避免染色對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運(yùn)動性、攝食特性、生長繁殖過程中形態(tài)變化等觀察,32,用途：微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)染色前需要對樣品固定.常用固定方法：酒精火焰加熱、化學(xué)固定,光學(xué)顯微樣品制備染色觀察,33,1)、簡單染色法：涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢2）、革蘭氏染色法：涂片固定結(jié)晶紫色染色水洗碘液媒染水洗酒精脫色番紅復(fù)染水洗干燥觀察,34,（二）、電子顯微鏡的制樣樣品在進(jìn)行電鏡觀察前必須進(jìn)行固定和干燥，制樣時一般采用重金屬鹽染色或噴鍍，提高在電鏡下的反差。,35,1、透射電鏡的樣品制備,負(fù)染技術(shù),投影技術(shù),超薄切片技術(shù),冰凍蝕刻技術(shù),36,負(fù)染法,將樣品的背景染色以凸現(xiàn)樣品，所以稱為負(fù)染法。,一般是采用電子密度高，本身不會顯示任何結(jié)構(gòu)，又和樣品不起反應(yīng)的物質(zhì)，如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍，同時染色劑還會進(jìn)入觀察對象的內(nèi)部，這樣，既能顯示外形，又可在一定程度上反映樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。,負(fù)染法原理,37,負(fù)染色法觀察的鞭毛,用途：可以觀察細(xì)菌細(xì)胞、病毒等。,38,在真空條件下，用電子散射能力強(qiáng)的重金屬原子來噴鍍樣品表面，這樣在樣品和沒有噴鍍的區(qū)域形成了較強(qiáng)的反差，而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影，根據(jù)投影了解樣品的立體形狀、高度。,投影法,39,投影法觀察的噬菌體,用途：觀察細(xì)菌的鞭毛或病毒的顆粒,40,這是最常用的方法，可以觀察細(xì)胞或其它樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。樣品固定脫水包埋切片。只有在20100納米厚度的切片用透射電子顯微鏡才能觀察，所以一般細(xì)菌樣品，一個細(xì)胞要分割成10片到50片。,超薄切片法,超薄切片法觀察的一種厭氧弧菌,41,樣品-196迅速冷凍加溫到-100切割樣品升華(真空)掉斷口處的冰重金屬噴鍍斷口表面電子顯微鏡觀察,冰凍蝕刻法,42,冰凍蝕刻法制備的酵母菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖,優(yōu)點(diǎn):可以避免在固定、脫水和包埋過程中造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的人為改變而形成的假象。,43,2、掃描電鏡樣品的制備,樣品先要經(jīng)過固定、脫水等處理，