第十三節(jié)-生化藥物制造工藝-糖類藥物.ppt

第五節(jié)糖類藥物一、糖類藥物概述糖類是自然界廣泛存在的一大類生物活性物質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)不少糖類物質(zhì)及其衍生物具有很高藥用價(jià)值，有些已在臨床廣泛應(yīng)用。多糖類藥物近來很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高機(jī)體免疫和抗腫瘤、抗輻射方面都具有顯著藥理作用與療效。隨著糖生物學(xué)的發(fā)展，糖類在生命過程中的重要作用的不斷揭示，對(duì)糖類藥物的研究也越來越受到重視。,（一）糖類藥物的分類糖類藥物種類繁多，其分類方法也有多種，按照含有糖基數(shù)目不同可分為以下幾類。（1）單糖類：如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和維生素C等。（2）低聚糖類：如蔗糖、麥芽乳糖、乳果糖等。（3）多糖類：多糖又有多種，根據(jù)其來源不同又可分為：來源于植物的多糖，如黃芪多糖、人參多糖、刺五加多糖；,來源于動(dòng)物的多糖，如肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等；來源于微生物的多糖，如香菇多糖、豬苓多糖、靈芝多糖、云芝糖肽等。（4）糖的衍生物：如1，6二磷酸果糖、6磷酸葡萄糖、磷酸肌醇等。,（二）多糖的藥理活性多糖具有十分廣泛的藥理生理作用：1、抗腫瘤和免疫促進(jìn)活性多糖對(duì)免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，從多個(gè)層次多個(gè)途徑激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。包括對(duì)各種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)以及對(duì)補(bǔ)體的調(diào)節(jié)等。香菇多糖已用于臨床，另外靈芝多糖、地黃多糖、冬蟲夏草多糖、海帶多糖、微藻多糖等也具有抗腫瘤活性。,2、抗病毒活性多糖類在結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞表面糖胺聚糖類似，競(jìng)爭(zhēng)抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)又是許多細(xì)胞表面分子的模擬配體，能直接與細(xì)胞結(jié)合，阻礙病毒的吸附。3、抗凝血活性肝素是天然抗凝劑，帶有負(fù)電荷。甲殼素、硫酸化昆布多糖、海帶多糖均具有體內(nèi)外抗凝血作用。蘆薈多糖、黑木耳多糖等也具有肝素樣的抗凝血作用。,4、抗氧化活性多糖可通過提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，從而保護(hù)生物膜。5、抗感染作用多糖可以提高機(jī)體組織細(xì)胞對(duì)細(xì)菌、原蟲、病毒和真菌感染的抵抗力。如甲殼素對(duì)皮下腫脹有治療作用，對(duì)皮膚傷口有愈合作用。6、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用類肝素、硫酸軟骨素、小分子量肝素等具有降血脂、降血膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，用于防治冠心病和動(dòng)脈硬化。,7、抗輻射、抗突變隨著人類對(duì)多糖研究的不斷深入。將會(huì)發(fā)現(xiàn)多糖更多的作用和用途。,二、糖類藥物制備的一般方法（一）單糖及其衍生物的制備游離單糖及小分子寡糖易溶于冷水及溫乙醇，單糖、雙糖類、三糖類、四糖類以及多元醇類。可以用水或在中性條件下以50乙醇為提取溶劑，也可以用82乙醇，在7078下回流提取。植物材料磨碎經(jīng)乙醚或石油醚脫脂，拌加碳酸鈣，（藥材中拌入碳酸鈣或氫氧化鋇，以防止酶和有機(jī)酸的影響。）以50乙醇溫浸，用中性醋酸鉛去雜蛋白及其他雜質(zhì)，鉛離子可通H2S除去，再濃縮。,醇液經(jīng)活性炭脫色、濃縮、冷卻、滴加乙醚，或置于硫酸干燥器中旋轉(zhuǎn)，析出結(jié)晶。單糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附層析法或離子交換法進(jìn)行純化。（二）多糖的分離與純化多糖可來自動(dòng)物、植物和微生物。來源不同，提取分離方法也不同。植物體內(nèi)含有水解多糖衍生物的酶，必須抑制或破壞酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。,因溫度升高，使多糖受到內(nèi)源酶的作用。速凍冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。提取方法依照不同種類的多糖的溶解性質(zhì)而定。酸性黏多糖常含有氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸基等多種結(jié)構(gòu)成分，且常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，提取分離時(shí)，通常先用蛋白酶或濃堿、濃中性鹽解離蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合鍵后，用水提取。,1、多糖的提取提取多糖時(shí)，一般需先進(jìn)行脫脂，以便多糖釋放。方法是將材料粉碎，用甲醇或1：1乙醇乙醚混合液，加熱攪拌13h，也可用石油醚脫脂。動(dòng)物材料可用丙酮脫脂、脫水處理。多糖的提取方法主要有以下幾種。（1）難溶于冷水、熱水，可溶于稀堿液者對(duì)甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸絡(luò)合物的多糖，可加入硼砂，此法可得相當(dāng)純的物質(zhì)。,（2）易溶于溫水、難溶于冷水和乙醇者材料用冷水浸過，用熱水提取，必要時(shí)可加熱至8090攪拌提取，提取液用正丁醇與三氯甲烷混合液除去雜蛋白（或用三氯乙酸除雜蛋白），透析后用乙醇沉淀得多糖。（3）黏多糖因大部分黏多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合于細(xì)胞中，因此需用酶解法或堿解法使糖蛋白質(zhì)間的結(jié)合鍵斷裂，促使多糖釋放。堿解法可以防止黏多糖分子中硫酸基的水解破壞，也可以同時(shí)用酶解法處理組織。,堿解法。多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖肽鍵對(duì)堿不穩(wěn)定，故可用堿解法使糖與蛋白質(zhì)分開。黏多糖分子上的硫酸基一般對(duì)堿較穩(wěn)定，但若硫酸基與鄰羥基處于反式結(jié)構(gòu)或硫酸基在C3或C6上，此時(shí)易發(fā)生脫硫作用。因此對(duì)這類多糖不宜用堿解法提取。酶解法。蛋白酶水解法已逐步取代堿提取法而成為提取多糖的最常用方法。鑒于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，因此成品中會(huì)保留較長(zhǎng)的肽段。為除去長(zhǎng)肽段，?？膳c堿解法合用。,2、多糖的純化多糖的純化方法很多，但必須根據(jù)目的物的性質(zhì)及條件選擇合適的純化方法。一種方法不易得到理想的結(jié)果，因此必要時(shí)應(yīng)考慮合用幾種方法。（1）乙醇沉淀法乙醇沉淀法是制備黏多糖的最常用手段。乙醇的加入，改變了溶液的極性，導(dǎo)致糖溶解度下降。如使用充分過量的乙醇，黏多糖濃度少于01也可以沉淀完全。向溶液中加入一定濃度的鹽，如醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨或氯化鈉有助于使黏多糖從溶液中析出，鹽的最終濃度5即足夠。使用醋酸鹽的優(yōu)點(diǎn)是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇過量時(shí)，也不會(huì)發(fā)生這類鹽的共沉淀。,加完乙醇，攪拌數(shù)小時(shí)，以保證多糖完全沉淀。沉淀物可用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，真空干燥即可得疏松粉末狀產(chǎn)品。（2）分級(jí)沉淀法不同多糖在不同濃度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同濃度的有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀分子量大小不同的黏多糖。在Ca2、Zn2十等二價(jià)金屬離子的存在下，采用乙醇分級(jí)分離黏多糖可以獲得最佳效果。,（3）季銨鹽絡(luò)合法黏多糖與一些陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨和十六烷基氯化吡啶（CPC）等能形成季銨鹽絡(luò)合物。這些絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶解，在離子強(qiáng)度大時(shí)，這種絡(luò)合物可以解離、溶解、釋放。無機(jī)鹽濃度（臨界鹽濃度）主要取決于聚陰離子的電荷密度。黏多糖的硫酸化程度影響其電荷密度。季胺鹽的沉淀能力受其烷基鏈中的亞甲基數(shù)的影響，還可以用不同種季銨鹽的混合物作為酸性黏多糖的分離沉淀劑。應(yīng)用季銨鹽沉淀多糖是分級(jí)分離復(fù)雜黏多糖的最有用方法之一。,（4）離子交換層析法黏多糖由于具有酸性基團(tuán)如糖醛酸和各種硫酸基，在溶液中以聚陰離子形式存在，因而可用陰離子交換劑進(jìn)行交換吸附。洗脫時(shí)可以逐步提高鹽濃度如梯度洗脫或分步階段洗脫。（5）凝膠過濾法凝膠過濾法可根據(jù)多糖分子量大小不同進(jìn)行分離。此外，區(qū)帶電泳法、超濾法及金屬絡(luò)合法等在多糖的分離純化中也常采用。,3、溶液中多糖濃度的測(cè)定（1）蒽酮硫酸比色法測(cè)定糖含量糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑結(jié)合產(chǎn)生顏色反應(yīng)，反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色，于620nm處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線：以“0”管作空白對(duì)照，620nm處的吸光度，以吸光度對(duì)葡萄糖濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品液0.1ml，按上述步驟操作，測(cè)光密度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。,（2）3，5二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定還原糖在堿性溶液中，DNS與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法可測(cè)定樣品中的含糖量。（3）苯酚硫酸比色法苯酚硫酸試劑可與多糖中的己糖、糖醛酸起顯色反應(yīng)，在490nm處有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。,（4）葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖葡萄糖氧化酶專一氧化葡萄糖，生成葡萄糖酸和過氧化氫，再利用過氧化物酶催化過氧化氫氧化某些物質(zhì)如鄰甲氧苯胺使其從無色轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩ㄟ^比色法計(jì)算葡萄糖含量。葡萄糖溶液中葡萄糖和葡萄糖存在著動(dòng)態(tài)平衡，隨著葡萄糖的氧化，最終所有型全部轉(zhuǎn)變成型被氧化。（5）Nelson法還原糖將銅試劑還原生成氧化亞銅，在濃硫酸存在下與砷鉬酸生成藍(lán)色溶液，在560nm下的吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。,4、純度檢查多糖的純度只代表某一多糖的相似鏈長(zhǎng)的平均分布，通常所說的多糖純品也是指具有一定分子量范圍的均一組分。多糖純度的鑒定通常有以下幾種方法：（1）常壓凝膠層析法凝膠層析法是根據(jù)在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫體積成一定關(guān)系的特性來進(jìn)行的。選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的保證。,（2）高效凝膠滲透色譜法HPLC法具有快速、高分辨率和重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，因此得到越來越多的應(yīng)用。用于HPLC的凝膠柱均為商品柱，其填料有疏水性的，也有親水性的，而且每根柱的孔徑不同，分離分子量的范圍亦不同。選用哪一種性質(zhì)的填料和用多大的排阻限和滲透限，主要取決于被分離溶質(zhì)的性質(zhì)和可能的分子量大小。多糖的檢測(cè)不采用柱后衍生化方法，而是采用直接檢測(cè)。,（3）比旋度法不同的多糖具有不同的比旋度，在不同濃度的乙醇中具有不同溶解度。如果多糖的水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀所得的沉淀具有相同比旋度，則該多糖為均一組分。（4）超離心法如果多糖在離心力場(chǎng)作用下形成單一區(qū)帶，說明多糖微粒沉降速度相同，表明其分子的密度、大小和形狀相似。,三、重要糖類藥物的制備糖類藥物品種繁多，現(xiàn)根據(jù)其來源、性質(zhì)及工藝特點(diǎn)不同，主要介紹具有代表性的幾個(gè)重要品種的生產(chǎn)工藝。（二）1，6-二磷酸果糖（1)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1，6-二磷酸果糖是果糖的1，6-二磷酸酯，其分子形式有游離酸FDPH4與鈉鹽如1，6-二磷酸果糖三鈉鹽（FDPNa3H）等。FDPNa3H為白色晶形粉末，有旋光，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。,2、生產(chǎn)工藝1）酶轉(zhuǎn)化工藝（1）工藝路線：,取經(jīng)多代發(fā)酵應(yīng)用過的酵母渣，懸浮于適量蒸餾水中，反復(fù)凍融3次，加入底物（8蔗糖，4NaH2PO4，30mmolLMgCl2，pH6.5）于30，反應(yīng)6h。除雜蛋白煮沸5min。陰離子交換柱層析轉(zhuǎn)酸FDPCa沉淀懸浮于水中，732樹脂轉(zhuǎn)酸，NaOH調(diào)pH535.8，除菌過濾后，凍干。,（三）肝素1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)肝素是天然抗凝劑，是一種含有硫酸基的酸性粘多糖。肝素及其鈉鹽為白色或灰白色粉末，無臭無味，有吸濕性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六環(huán)等有機(jī)溶劑，其游離酸在乙醚中有一定溶解性。肝素分子中含有硫酸基與羧基，呈強(qiáng)酸性，為聚陰離子，能與陽離子反應(yīng)成鹽。硫酸化程度高的肝素具有較高的降脂和抗凝活性。小分子量肝素（分子量40005000）具有較低的抗凝活性和較高的抗血栓形成活性。,2、生產(chǎn)工藝肝素系廣泛分布于哺乳動(dòng)物的肝、肺、心、脾、腎、胸腺、腸粘膜、肌肉和血液里。其生產(chǎn)工藝主要有鹽解-季胺鹽沉淀法，鹽解-離子交換法和酶解-離子交換法。肝素在組織內(nèi)和其他粘多糖一起與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，因此肝素制備過程包括肝素蛋白質(zhì)復(fù)合物的提取、解離和肝素的分離純化兩個(gè)步驟。,1）鹽解-離子交換生產(chǎn)工藝（1）工藝路線：,繼續(xù)升溫至95，維持10min。95乙醇沉淀過夜NaOH調(diào)PH11，按3量加入H2O2（H2O2濃度30），共48小時(shí)。去熱原、雜質(zhì)。,3、檢驗(yàn)方法4、作用與用途肝素是典型的抗凝血藥，能阻止血液的凝結(jié)過程，用于防止血栓的形成。,（四）小分子肝素1、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)肝素通過與AT結(jié)合并抑制a因子和Xa因子活性而發(fā)揮抗栓、抗凝作用。,（2）工藝過程降解。HCl調(diào)pH至2.8，加NaNO2反應(yīng)，反應(yīng)溫度為1825，用KI試紙控制終點(diǎn)。還原。調(diào)節(jié)pH至9.8，反應(yīng)溫度為1825，加NaBH4反應(yīng)2h。沉淀。調(diào)節(jié)pH至5.56.6，95乙醇沉淀，得小分子肝素粗品。蒸餾水溶解，95乙醇沉淀。蒸餾水溶解，95乙醇沉淀。得小分子肝素精品。,3、檢驗(yàn)方法抗Xa因子活性測(cè)定抗IIa因子活性測(cè)定4、作用和用途小分子量肝素鈉具有抗Xa因子活性，藥效學(xué)研究表明小分子量肝素鈉對(duì)體內(nèi)、外血栓，動(dòng)靜脈血栓的形成有抑制作用。,（