流式細胞儀(20zz年) 教育學習

流式細胞儀,流式細胞儀（flowcytometer，F(xiàn)CM）是以激光為光源、檢測生物學顆粒理化性質(zhì)的儀器。生物學顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、染色體、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、細胞器、病毒顆粒、細菌、真菌、真核細胞、雜交細胞、聚集細胞等。理化性質(zhì)包括細胞大小、細胞形狀、細胞膜完整性、胞漿顆?；潭?、DNA含量、總蛋白含量、酶活性等。,1,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-流式細胞術(shù),流式細胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）流式細胞術(shù)是應(yīng)用流式細胞儀對懸浮液中的細胞或細胞器進行快速測量和多參數(shù)檢測的細胞分析技術(shù)。同時依賴測量到的參數(shù)還可以用物理的方法將一個群體中的細胞亞群分選出來，即流式細胞分選術(shù)（cellsorting）。流式細胞術(shù)綜合應(yīng)用了激光技術(shù)、流體力學、細胞生物化學技術(shù)、熒光標記技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、分子生物學技術(shù)、計算機技術(shù)及臨床醫(yī)學等多門技術(shù)。,2,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-發(fā)展歷史,流式細胞儀的發(fā)展歷史1934年，Moldavan使懸浮的紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來。這就是流式細胞儀的雛形。1965年，Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色細胞，給出細胞中核酸的含量和細胞大小。奠定了多參數(shù)流式細胞測量的基礎(chǔ)。,3,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-發(fā)展歷史,1967年，VanDilla和LosAlamos采用了層流流動室和氬激光器，開發(fā)出了液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者相互垂直的流式細胞儀。這成為目前各種流式細胞儀的基礎(chǔ)。1969年，F(xiàn)ulwyler利用靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細胞儀變成了低分辨率的流式細胞儀。,4,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-發(fā)展歷史,20世紀70年代，隨著Kohler和Milstein成功提出了單克隆抗體技術(shù)和熒光標記技術(shù)，為特異研究和分析細胞奠定了良好的基礎(chǔ)。1973年，美國BD公司和美國斯坦福大學合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界上第一臺商用流式細胞儀FACSI。,5,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-發(fā)展歷史,20世紀80年代，流式細胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增加，新的熒光染料和細胞標記物的出現(xiàn)，使流式細胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大。20世紀90年代，與之配套的標本制備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀逐漸從科研單位進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科，成為現(xiàn)代化的臨床檢驗儀器的一部分。,6,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-發(fā)展歷史,目前，流式細胞儀同時朝著更加專業(yè)化和更加普及化的兩個不同的方向發(fā)展。更加專業(yè)化是指儀器更精密、更靈敏地進行更多參數(shù)的分析和更快、更純地進行細胞分選。更加普及化是指儀器更易于使用，使之成為實驗室里更常用的儀器。,7,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-特點,FCM與其他細胞分析技術(shù)相比，有如下特點：高速度：每秒可檢測10005000個細胞。高靈敏度：每個細胞只要帶有10003000個熒光分子就能檢出，兩個細胞之間有5%的差別就可區(qū)分出來，光散射的靈敏度為0.3um。高精度：在細胞懸液中測量細胞，比其他分析技術(shù)的變異系數(shù)更小，分辨率高。高純度：分選細胞的純度可大于99%以上。多參數(shù)：可同時定量檢測單個細胞的DNA等多個參數(shù)。在適當?shù)臈l件，可對活細胞進行無害性分析和分選。,8,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-分類,流式細胞儀的分類根據(jù)功能不同，可分為臨床型和綜合型（科研型）。根據(jù)有無細胞分選功能，可分為流式細胞分析分選儀和流式細胞分析儀。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，可分為一般流式細胞儀（零分辨率流式細胞儀）和狹縫掃描流式細胞儀（高分辨率流式細胞儀）。前者的激光光斑為橢圓形，光斑直徑大于被檢細胞體積。后者激光光束為一條線狀扁平光斑，直徑在35um。,9,優(yōu)質(zhì)課件,流式細胞儀-學習內(nèi)容,流式細胞儀的基本原理流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細胞儀的性能指標流式細胞儀的使用流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀實例,10,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,基本原理：將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后，放入樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，流動室充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排列成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱，液柱與水平方向的入射激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細胞受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被成90角方向放置的光電倍增熒光檢測器和前向角放置的光電二極管檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號。電子信號經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機。計算機通過相應(yīng)的軟件儲存、計算、分析，就可以得到細胞的大小和活性、核酸含量等理化指標。,示意圖,11,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,細胞分選原理：在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號，使之產(chǎn)生同頻率的機械振動，流動室也隨之振動，這樣通過測量區(qū)的液柱斷裂成一連串均勻的液滴。在細胞形成液滴以前，各類細胞的特性已在測量區(qū)被測定并儲存。如果其特性與要分選的細胞相同時，儀器就在這類細胞形成液滴時給該液滴充與指定的電荷，這樣，當被選定的細胞形成液滴時就帶有特定的電荷，未被選定的細胞形成的細胞液滴及不含細胞的空白液滴不被充電，也就不帶電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依據(jù)所帶電荷符號向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，不帶電荷的液滴不發(fā)生偏轉(zhuǎn)，垂直落入廢液槽中排出，從而實現(xiàn)細胞的分類。,12,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,熒光染色原理免疫熒光染色：細胞膜上或細胞內(nèi)的抗原分子與相應(yīng)的熒光素標記McAb作用一定時間后形成帶有熒光素的抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出特定的熒光，其熒光強度與被測定抗原分子含量呈比例關(guān)系，由此可求得被測細胞與標記McAb相對應(yīng)抗原的表達量和陽性細胞百分比。常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻青蛋白（APC）和Perdinin葉綠素（PerCP）等，經(jīng)488nm激光激發(fā)后其發(fā)射熒光光譜有差別，因而可將其用于標記不同的McAb進行單色或多色免疫熒光染色。目前，流式細胞術(shù)有單色、雙色、三色、四色、五色熒光分析，對細胞的分析更加精密、深入。,13,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,免疫熒光染色常用方法：直接免疫熒光法：用一種（單色）或者多種（多色）熒光素標記的McAb染色細胞后測量其熒光強度和陽性細胞數(shù)。間接免疫熒光法：用一種McAb與細胞作用后，洗去未結(jié)合McAb，再加入熒光素標記的第二抗體（如羊抗鼠IgG-FITC），染色細胞后測量其熒光強度及陽性細胞數(shù)。,14,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,熒光染色原理普通熒光染色：用熒光染料直接染細胞中相應(yīng)的成分。如核酸染色。核酸染色：多種熒光染料如碘化丙啶（PI）、赫斯特（hoechst，HO）、色霉素A3（CA3）等可與DNA分子結(jié)合，其中以PI最常用。PI可選擇性地嵌入DNA分子雙螺旋的堿基之間，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出橙紅色熒光，其熒光強度與細胞DNA分子含量成比例關(guān)系，可用于DNA倍體及細胞周期分析。,15,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,單色直接免疫熒光染色,16,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,單色直接免疫熒光染色：異硫氰酸熒光素（FITC）分子標記McAb直接熒光染色后，熒光顯微鏡下可見發(fā)射綠色熒光的陽性細胞。,17,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,雙色直接免疫熒光染色,18,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,雙色直接免疫熒光染色：異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE）兩種熒光素分子標記的McAb直接熒光染色后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）和黃綠色熒光（FITC和PE雙染色）的三種陽性細胞。,19,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,三色直接免疫熒光染色,20,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,三色直接免疫熒光染色：用異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）、別藻藍蛋白（APC）三種熒光素標記的McAb直接熒光染色后，熒光顯微鏡下可見綠色（FITC）、橙色（PE）、紅色（APC）和兩種或三種染色混合的陽性細胞。,21,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,核酸染色：細胞經(jīng)透膜處理后，PI分子與細胞核中的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見呈紅色熒光的細胞核。,22,優(yōu)質(zhì)課件,I流式細胞儀的基本原理,+,-,樣品液,鞘液,前向角散射光檢測器,90角熒光檢測器,氬激光光源,流動室,噴嘴,測量區(qū),+,偏轉(zhuǎn)板,樣品管,收集器,圖：工作原理示意圖,23,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu),流式細胞儀基本結(jié)構(gòu)包括五部分：（）光源（）液流系統(tǒng)（）信號接收系統(tǒng)（）信號處理系統(tǒng)（）細胞分選器以上整個系統(tǒng)由電子電路和計算機控制，用以收集、顯示、分析、儲存被測定的各種信號及控制細胞的分選收集。,24,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu),光源,液流系統(tǒng),信號接收,信號處理,細胞分選,圖：流式細胞儀構(gòu)成示意圖,25,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1）,光源流式細胞儀中使用的光源多為氬離子激光器。氬離子激光器是一種氣體激光器，通過氣體放電使氬離子電離并激發(fā)，實現(xiàn)粒子數(shù)反轉(zhuǎn)而產(chǎn)生激光，譜線有十余條，其中綠光514nm和藍光488nm兩條譜線最強。選擇哪條譜線作為激發(fā)光源，主要是依據(jù)熒光染料的激發(fā)光譜而定，越接近被其激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號越強。,26,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（1）,激光（Laser）光源激光的特性良好的單色性單向性發(fā)散角小,27,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)是樣品和鞘液（生理鹽水或磷酸鹽緩沖液）進入、流動、排出的通道。由氮氣加壓系統(tǒng)、鞘流瓶、樣品管、流動室、噴嘴等組成。在高壓氮的壓力下，樣品液進入樣品管，在流動室與鞘液相混，以樣品流居中、鞘液流包繞的流束形式到達經(jīng)特殊設(shè)計的噴嘴，并以穩(wěn)流的形式噴出，在噴嘴附近的測量區(qū)被測量后，形成液滴，進入分選器，未被分選的細胞和鞘液排入廢液槽。,28,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,激光束,熒光檢測器,散射光檢測器,圖：內(nèi)檢式流動室示意圖,29,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,激光束,熒光檢測器,散射光檢測器,鞘液,圖：在空氣中檢測流動室示意圖,樣品液,30,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,熒光顯微鏡,環(huán)狀結(jié)構(gòu),鞘液,圖：顯微檢測流動室示意圖,樣品液,31,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,圖：四種典型流動室示意圖（）,（1）,（2）,32,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,圖：四種典型流動室示意圖（2）,（3）,（4）,33,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,FACSCalibur流式細胞儀的樣品流動,34,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,信號接收系統(tǒng)流式細胞儀主要接收細胞的散射光信號和熒光信號，并將其轉(zhuǎn)換為與散射光和熒光強度成正比的電壓脈沖。,35,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞通過測量區(qū)時信號的產(chǎn)生,36,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞通過測量區(qū)時信號的產(chǎn)生：電壓脈沖的形成,37,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,散射光信號細胞在通過激光測量區(qū)時，在空間360立體角的所用方向散射光線，散射光信號與細胞大小、形狀、質(zhì)膜及細胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。在流式細胞儀中，通常在前向角和側(cè)向角接收和檢測細胞散射光，前者的檢測器多用硅光電二極管，后者的檢測器多用光電倍增管。,38,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,散射光信號前向角散射光（forwardscatter，F(xiàn)SC）：亦稱小角散射或0散射。激光在此方向上有較強的衍射光，當用遮光板除去本底光的影響時，該方向上的散射光強度是d/的函數(shù)，表示激光波長，d表示細胞大小。FSC參數(shù)反映細胞的大小和尺寸。側(cè)向角散射光（sidescatter，SSC）：亦稱大角散射或90散射。激光在此方向上衍射光明顯減弱，而以反射光、散射光成分為主。SSC參數(shù)反映細胞內(nèi)顆粒物質(zhì)的大小和多少，可獲取有關(guān)細胞內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。,39,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,散射光信號,40,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,熒光信號（fluorescence，F(xiàn)L）被熒光染料染色的細胞在通過測量區(qū)時，細胞中的特異熒光染料受激發(fā)而產(chǎn)生熒光信號，其強度表示待檢測物質(zhì)的多少。熒光信號檢測系統(tǒng)由濾片和檢測器組成，與入射激光成90放置。濾片用以濾除非熒光信號；熒光檢測器多用光電倍增管。熒光波長與激發(fā)光波長不同且強度轉(zhuǎn)弱，須使用一系列靈敏的光學元件才能分離出不同的熒光信號。,41,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,熒光信號：細胞中熒光素含量與信號的關(guān)系,42,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,熒光信號：細胞中熒光素分布與信號的關(guān)系,43,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,信號處理系統(tǒng)檢測器以每秒10002000個細胞的速度探測細胞的散射光和熒光信息，經(jīng)過A/D轉(zhuǎn)換器變成二進制信號，儲存于計算機中，每個細胞的光散射及熒光測量數(shù)據(jù)一般以列表或矩陣方式儲存。計算機通過綜合、處理、分析這些信息，可直接計算出所需結(jié)果。,44,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,電壓脈沖定量分析與數(shù)字轉(zhuǎn)換（1）,45,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,電壓脈沖定量分析與數(shù)字轉(zhuǎn)換（2）：脈沖高度,46,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞信號的顯示一維直方圖（histogram）單參數(shù)直方圖表示一個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關(guān)系。在圖中，橫坐標（X軸）表示熒光或散射光強度的相對值，其單位用在流式細胞儀中用“道（channel）”表示，道數(shù)與熒光強度之間是線性或?qū)?shù)關(guān)系，依儀器分析時放大器的性質(zhì)而定?？v坐標（Y軸）通常代表細胞出現(xiàn)的頻率或相對細胞數(shù)量，絕對細胞數(shù)較少使用。在直方圖中，每個峰表示在某些方面性質(zhì)相同的一群細胞，若用“標尺”把各峰分開成區(qū)間，即可統(tǒng)計分析出各個區(qū)間內(nèi)細胞所占百分比、及光散射或熒光強度的峰值、平均值、標準差、變異系數(shù)等。,47,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,直方圖,48,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,直方圖,49,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,直方圖,50,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,直方圖標準熒光微球的熒光直方圖：測試前必須用標準熒光微球校準儀器。,51,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,直方圖T淋巴細胞單色直接免疫熒光染色的熒光直方圖：以藍色直方圖為同型對照設(shè)定陰性與陽性細胞界標（Marker，M1），凡在M1左邊的細胞為陰性，右邊的細胞為陽性。,52,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞信號分析的主要形式二維點圖（dotplot）二維點圖表示兩個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關(guān)系。任選FSC、SSC、FL1FL3中兩個參數(shù)為X軸和Y軸，就可得到二維點圖。在二維點圖中，每個點代表一個細胞，根據(jù)細胞性質(zhì)的不同，在二維點圖上就會出現(xiàn)若干群細胞，即為不同的細胞亞群。若用“門”把各亞群細胞分開并進行統(tǒng)計分析，可得各亞群細胞所占百分比、及平均熒光強度等。,53,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,二維點圖,54,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,二維點圖白細胞散射光FSC/SSC二維點圖及二維密度圖。,55,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,二維點圖T細胞亞群CD3/CD4和CD3/CD8二維點圖：CD3/CD4雙陽性細胞（T輔助細胞）占45.04%。CD3/CD8雙陽性細胞（T抑制細胞）占34.05%。,56,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞信號分析的主要形式假三維圖及二維等高圖（contour）假三維圖：任選FSC、SSC、FL1FL3中任何兩個參數(shù)為X軸和Y軸，以細胞數(shù)量為Z軸，就構(gòu)成了三維圖。因Z軸細胞數(shù)量不是直接測量參數(shù)，實際上仍是二維圖，故稱為假三維圖。該圖對細胞亞群的觀察更為直觀。二維等高圖：用不同高度的平面切割假三維圖，將這些切割投影到X、Y平面上，就形成了等高圖，等高圖由類似地圖上的等高線組成，等高線密集的地方，就是細胞數(shù)變化快的地方。該圖對觀察細胞的分布趨勢優(yōu)于二維點圖。,57,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,假三維圖及等高圖白細胞散射光FSC、SSC假三維圖（左）與等高圖（右）。,58,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞信號分析的主要形式三維圖（3D）及四參數(shù)平面圖三維圖：在FSC、SSC、FL1FL3中任選三個參數(shù)為X軸、Y軸和Z軸，就構(gòu)成了一個三維圖，在三維空間中，每一群細胞各處于獨立的空間位置。該圖對復(fù)雜的細胞亞群分析更為直觀、準確，但對其數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析較難。四參數(shù)平面圖：四參數(shù)平面圖分析對數(shù)據(jù)分布的觀察也有一定意義。,59,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,三維圖白細胞CD45、CD14、SSC三參數(shù)三維圖：紅色-淋巴細胞黃色-嗜堿性粒細胞天藍-單核細胞藍色-中性粒細胞品紅-嗜酸性粒細胞,60,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,四參數(shù)平面圖白細胞FSC、SSC、CD45、CD14、SSC四參數(shù)平面圖：紅色-淋巴細胞黃色-嗜堿性粒細胞天藍-單核細胞藍色-中性粒細胞品紅-嗜酸性粒細胞。,61,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞信號的分析散射光信號分析熒光信號分析散射光/熒光信號分析,62,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,散射光分析散射光（FSC、SSC）可用直方圖、二維點圖、假三維圖、三維圖等分析,A-白細胞FSC直方圖。B-白細胞SSC直方圖。C-白細胞FSC/SSC二維圖：可分辨L、M、粒細胞。D-紅細胞/血小板FSC直方圖。E-紅細胞/血小板SSC直方圖。F-紅細胞/血小板FSC/SSC二維點圖。,63,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,熒光分析熒光（FL1、FL2、FL3）可用直方圖、二維點圖等分析。,A-CD8直方圖。B-CD3/SSC二維點圖：設(shè)門，R1為CD3+T淋巴細胞。C-R1中CD3+T淋巴細胞CD4/CD8二維圖。D-FSC/SSC二維點圖：設(shè)門，R2淋巴細胞分布區(qū)。E-R2中淋巴細胞CD3/CD4二維點圖。F-R2中淋巴細胞CD3/CD8二維圖。,64,優(yōu)質(zhì)課件,II流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)（）,細胞分選器：由水滴形成、分選邏輯電路、水滴充電及偏轉(zhuǎn)這三部分組成。通過給壓電晶體的振動使自噴嘴噴出的流束形成水滴，分選邏輯電路根據(jù)分選細胞的參數(shù)，給含有此參數(shù)的細胞液滴充電，充電的液滴經(jīng)過電極偏轉(zhuǎn)板時，依所帶電荷的不同而偏向不同的電極板，在電極的下方放置收集容器，即可得到分選的細胞。,65,優(yōu)質(zhì)課件,III流式細胞儀的性能指標,熒光分辨率：表示儀器測量所能達到的最大精度，通常用變異系數(shù)表示。目前，儀器的熒光分辨率都在2%以下。熒光靈敏度：表示儀器所能檢測到的最少熒光量，通常用能檢測到的最少的異硫氰酸熒光素（FITC）分子來表示。一般儀器的熒光靈敏度為3000個FITC分子。前向角散射光靈敏度：以前向角散射光能檢測到的最小顆粒直徑表示。一般儀器可檢測到的最小顆粒直徑在0.3um左右。,66,優(yōu)質(zhì)課件,III流式細胞儀的性能指標,前向角散射光分辨率：用變異系數(shù)表示。一般約在2%，但多數(shù)廠家不給出此值。分析/分選速度：分析速度可達每秒500010000個細胞，分選速度為每秒5000個細胞通過測量去。實用時為保證分析或分選精度，常在每秒1000個以下。分選純度：分選純度不但與儀器精度有關(guān)，還與被分選的細胞亞群在整個群體中的相對位置有關(guān)。若被分選的亞群在直方圖或二維點圖上可清晰地分辨出來且與其他亞群無重疊，分選純度就高，反之就低。,67,優(yōu)質(zhì)課件,III流式細胞儀的性能指標,分選收獲率：是指通過測量區(qū)應(yīng)被分選的細胞中實際落到指定收集器中的細胞數(shù)目所占的百分比。一般儀器在90%以上。分選收獲率和分選純度是相互制約的，純度低，收獲率就高，純度高，收獲率就低。除了以上7個參數(shù)外，還有其他指標，如樣品濃度、同時可測參數(shù)、光源、噴孔尺寸、計算機配置等。,68,優(yōu)質(zhì)課件,IV流式細胞儀的使用,流式細胞儀的安裝流式細胞儀的調(diào)校流式細胞儀的測試方法流式細胞儀的維護流式細胞儀的常見故障及排除,69,優(yōu)質(zhì)課件,IV流式細胞儀的使用,流式細胞儀的測試方法：一般包括5個步驟。制備合格的單細胞懸液。在FCM技術(shù)中，制備出合格的單個細胞懸液是最為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。對需測量的細胞生物化學成分進行熒光標記染色。進行流式細胞儀測量。對測量資料進行定量分析。對測量分析結(jié)果在生物學上的意義予以解釋。,70,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,流式細胞技術(shù)在細胞生物學中的應(yīng)用流式細胞技術(shù)在免疫學中的應(yīng)用流式細胞技術(shù)在腫瘤學中的應(yīng)用流式細胞技術(shù)在血液學中的應(yīng)用,71,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,流式細胞儀在臨床血液學中的應(yīng)用白血?。貉毎螒B(tài)學檢查是白血病診斷的基礎(chǔ)，白血病免疫學分型是對形態(tài)學分型的重要補充和進一步深化。白血病MICM分型認為免疫學分型對每一例急性白血病診斷都是必不可少的，對下列情況意義更大：用形態(tài)學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。形態(tài)學為急性淋巴細胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血病（AUL），但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記?；旌闲园籽?。部分髓系白血病。慢性淋巴細胞白血病。白血病微小殘留病灶的檢測。,72,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,流式細胞儀在臨床血液學中的應(yīng)用白血?。耗壳?，國際公認的免疫表型分析方法是流式細胞技術(shù)，其方法是利用熒光素標記的單克隆抗體（McAb）作為分子探針，多參數(shù)分析白血病細胞的細胞膜和細胞質(zhì)或細胞核的抗原標記物，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度。（）FCM白血病免疫分型。（）急性白血病微小殘留病灶的監(jiān)測。（）白血病細胞DNA分析。（）急性白血病多藥耐藥的檢測。（）造血干/祖細胞移植,73,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,流式細胞儀在臨床血液學中的應(yīng)用陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）：PNH是一種因紅細胞的獲得性缺陷致使紅細胞對血清中補體敏感而發(fā)生的慢性血管內(nèi)溶血。其發(fā)病機制是PNH異常血細胞的細胞膜缺乏糖化肌醇磷脂（GPI）錨連的蛋白，如CD55可抑制補體激活，CD59可抑制膜反應(yīng)性溶解，其中CD59的缺乏對PNH溶血具有重要意義。用流式細胞儀檢測細胞表面錨連蛋白CD55、CD59正取代傳統(tǒng)的溶血檢查方法而成為診斷PNH的有效工具。目前研究認為用CD59單克隆抗體檢測紅細胞表面的CD59表達其結(jié)果最令人滿意，是診斷PNH較直接而又敏感可靠的方法。,74,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,流式細胞儀在臨床血液學中的應(yīng)用血栓與出血性疾?。和ㄟ^流式細胞儀來檢測血小板表面的特異抗原與糖蛋白（GP），已成為血栓性疾病和一些出血性疾病的一個新的診斷方法。（1）在血栓性疾病中的應(yīng)用檢測活化血小板：活化標志物CD62P、CD63等。測定血小板內(nèi)鈣流（2）在出血性疾病中的應(yīng)用特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）血小板無力癥（GP）巨大血小板綜合征（BSS）貯存池病血管性血友?。╲WD）,75,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,流式細胞儀在臨床血液學中的應(yīng)用網(wǎng)織紅細胞和網(wǎng)織血小板的檢測（1）網(wǎng)織紅細胞（RET）：網(wǎng)織紅細胞是無核的、胞質(zhì)中含有殘留RNA物質(zhì)的、未完全成熟的紅細胞。流式細胞技術(shù)中用熒光染料噻唑橙（TO）使RNA染色，再在流式細胞儀上檢測，根據(jù)熒光的有無和熒光強度的高低，可測定出網(wǎng)織紅細胞的百分率、絕對計數(shù)及分類。（2）網(wǎng)織血小板（RP）：網(wǎng)織血小板是指細胞質(zhì)中殘留有RNA物質(zhì)的血小板。RP與RET一樣都是剛從骨髓中釋放出來的未成熟細胞，隨著血小板的成熟，RP內(nèi)的RNA逐漸消失。RP能夠比較精確地反映骨髓中血小板的生成情況，測定方法與RET的FCM測定相似。,76,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,應(yīng)用舉例（1）網(wǎng)織紅細胞計數(shù)原理：用熒光染料噻唑橙（TO）使RNA染色，再在流式細胞儀上檢測，根據(jù)熒光的有無和熒光強度的高低，可測定出網(wǎng)織紅細胞百分比。分析參數(shù)有：FSC、SSC、FL1。分析圖形有：FSC/SSC二維圖、FL1直方圖等。,77,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)正常人血液煌焦油藍活體染色：可見顆粒型網(wǎng)織紅細胞。,78,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)正常人血液網(wǎng)織紅細胞分析：在FSC/SSC二維圖中設(shè)定紅細胞門R1，血小板門R2。將陰性對照（綠色）與待測標本（紅色）的FL1直方圖重疊，設(shè)定界標（M1）,使陰性對照的非特異性熒光率小于0.3%。分析待測標本中的網(wǎng)織紅細胞百分率為1.07%。,79,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)IDA患者血液煌焦油藍活體染色：網(wǎng)紅增多，可見顆粒型和破網(wǎng)型。,80,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)IDA患者網(wǎng)織紅細胞分析：在FSC/SSC二維圖中設(shè)定紅細胞門R1，血小板門R2。將陰性對照（綠色）與待測標本（紅色）的FL1直方圖重疊，設(shè)定界標（M1）,使陰性對照的非特異性熒光率小于0.3%。分析待測標本中的網(wǎng)織紅細胞百分率為4.78%。,81,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)AA患者血液煌焦油藍活體染色：網(wǎng)紅很難見到。,82,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)AA患者網(wǎng)織紅細胞分析：在FSC/SSC二維圖中設(shè)定紅細胞門R1，血小板門R2。將陰性對照（綠色）與待測標本（紅色）的FL1直方圖重疊，設(shè)定界標（M1）,使陰性對照的非特異性熒光率小于0.3%。分析待測標本中的網(wǎng)織紅細胞百分率為0.05%。,83,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)HA患者血液煌焦油藍活體染色：網(wǎng)紅明顯增多，可見各型。,84,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,網(wǎng)織紅細胞計數(shù)HA患者網(wǎng)織紅細胞分析：在FSC/SSC二維圖中設(shè)定紅細胞門R1，血小板門R2。將陰性對照（綠色）與待測標本（紅色）的FL1直方圖重疊，設(shè)定界標（M1）,使陰性對照的非特異性熒光率小于0.3%。分析待測標本中的網(wǎng)織紅細胞百分率為29.33%。,85,優(yōu)質(zhì)課件,V流式細胞儀的應(yīng)用,應(yīng)用舉例（2）白細胞分類計數(shù)原理：根據(jù)白細胞CD45、CD14抗原表達的差異，結(jié)合不同