CR與DNA提取一般方法.ppt

PCR原理+流程,烏桕DNA提取方法國內外相關文章,PCR原理,聚合酶鏈式反應簡稱PCR（英文全稱：PolymeraseChainReaction）(又稱：多聚酶鏈式反應），聚合酶鏈式反應，其英文PolymeraseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以迅速擴增。又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。,特點,具有特異性強靈敏度高操作簡便省時等特點。,用途,可用于基因分離克隆和核酸序列分析等基礎研究還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方,(1)擴增各種蛋白的基因：(2)PCR后的測序：可以很快地測出常規(guī)的PCR產物或單鏈的DNA序列(3)用于分子進化和種系發(fā)育的研究，研究其分子進化及種系發(fā)育是很有用的4)分析和診斷遺傳性疾病(5)對人類HLA基因的多肽性分析，對于某些基因突變，如腫瘤發(fā)生的研究等均很有用。,主要過程,PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構成,模板DNA的變性,模板DNA經加熱至92左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；,模板DNA與引物的退火(復性),模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；,引物的延伸,DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。,PCR的反應動力學PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應最終的DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。,PCR擴增物,PCR擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產物片段”則以算術倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。,所需材料,1.試劑和溶液(1)10PCR緩沖液500mM氯化鉀100mMTris-Cl(室溫時pH8.3)15mM氯化鎂(2)10mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs)溶液含有所有四種dNTPs(pH8.0),3)耐熱的DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶是從表達克隆嗜熱水生菌的DNA聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有53DNA聚合酶和53外切酶活性，但是缺乏35外切酶活性。rTthDNA聚合酶是Thermusthermophilus(Tth)和Thermococcuslitoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有53DNA聚合酶和35外切酶(校正)的雙重活性。當按推薦量使用時，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產量。,(4)瓊脂糖凝膠(5)10M的上游和下游引物(6)DNA模板(7)對照DNA(含有靶序列的DNA)(8)DNA長度標準參照物,2.設備,(1)0.2mlPCR擴增管,(2)可預先設定擴增方案的溫度循環(huán)器(PCR儀),實驗操作,1、按以下次序，將各成分加入0.2ml滅菌擴增管中：成分體積終濃度10PCR緩沖液5l110mMdNTP溶液(pH8.0)1l每種0.2mM10M上游引物2.5l0.5M10M下游引物2.5l0.5M5單位/l耐熱DNA聚合酶0.5l2.5單位DNA模板1-10l1pg-1g消毒的蒸餾水至50l,2將小管中的混合物混勻并加入50l礦物油或硅化油覆蓋小管中的混合物。3蓋緊小管，短暫離心，以使PCR混合物沉于管底。,4小管在溫度循環(huán)器(PCR儀)中94C溫育3分鐘，以使模板DNA完全變性。,5.按以下方法進行25-35個循環(huán)的PCR擴增：變性94C30秒退火55C30秒延伸72C1分鐘/1kb,672C溫育PCR樣本10分鐘，可于4C維持。樣本可貯存于-20C直至使用。7采用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應產物，溴化乙錠染色顯影DNA，用合適分子量標準的DNA作參照。,電泳,PCR熒光定量,結果,植物DNA提取方法,1.CTAB法2.SDS法3.高鹽法,烏桕DNA提取方法,1.CTAB法2.SDS法,CTAB法提取植物基因組DNA,這種方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的簡便方法。CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復合物與蛋白，多糖類物質分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。,一材料、試劑和儀器,1材料新鮮的組織材料或-80凍存的材料葉子和種子的胚乳為材料,2試劑,(1)2CTAB溶液CTAB(W/V)2%Tris-HCL100MMOL/LPH8EDTA20MMOLPH8NACL1.4MOL/LPVP1%滅菌備用,(2)氯仿/異戊醇（24:1）(3)RNaseA10mg/ml(4)乙醇或異丙醇(5)-巰基乙醇（6）氯仿/異戊醇（25/24/1）（7）70%乙醇,3.儀器:,a、離心機,b、恒溫水浴,c、電泳裝置,實驗步驟,1.在2mL離心管中，加入500l的2CTAB和20l-巰基乙醇,65預熱。2、嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到預熱的離心管中，總體積達到1mL混勻后置65水浴中保溫45-60min，并不時輕輕轉動試管。注：凍存材料直接研磨，絕對不能化凍。而且粉末應在化凍前轉移否則內源性Dnase有可能降解基因組DNA。,3.加等體積的氯仿/異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下10000rpm離心10min，移上清至另一新管中。4.向管中加入1/100體積的RNaseA溶液，置3720-30min。5.加入2倍體積的100%乙醇或0.7倍體積異丙醇，會出現(xiàn)絮狀沉淀，-20放置30min或-80放置10min，12000rpm離心10-15min回收DNA沉淀。6.用70%乙醇清洗沉淀兩次，吹干后溶于適量的滅菌ddH2O中。7.0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。,SDS法,原理：SDS（十二烷基苯磺酸鈉）是一種陰離子去垢劑，在高溫條件下能裂解細胞，使染色體離析、蛋白變性，同時SDS與蛋白質和多糖結合成復合物，釋放出核酸；通過提高鹽濃度并降低溫度，使SDS-蛋白質復合物的溶解度變得更小，從而使蛋白質及多糖雜質沉淀更加完全，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,試劑,(1)提取緩沖液Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）EDTA50mmol/L（pH8.0）NaCl500mmol/L滅菌后加-巰基乙醇至10mmol/L,(2)裂解液20%SDS(3)高鹽溶液5mol/LKAc(4)RNaseA10mg/ml(5)異丙醇(6)滅菌ddH2O或TE,實驗程序,1、取幼嫩的組織材料1-2g,用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉移粉末到加有500L提取液的離心管中,輕輕混勻。2、向管中加入50L20%SDS溶液，混勻，不可過于強烈震蕩以防基因組DNA斷裂，65保溫10min，并不時搖動。3、加入150L5mol/LKAc，混勻，置冰上20-30min。,4、4,15000rpm離心15min,轉移上清到另一離心管中，加入0.7V的異丙醇，混勻，-20沉淀30min。5、12000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀，吹干后加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。6、加入1/10體積的RNaseA，37保溫20min，除去RNA7、CI抽提后，加2V乙醇，-20沉淀30min。12000rpm離心10min回收基因組DNA沉淀。8、用400L70%乙醇洗一次后，吹干，加入適量的滅菌ddH2O或TE溶解DNA。,9、電泳檢測完整性。,采用瓊脂糖凝膠電泳方法，觀察電泳圖來判斷DNA完整性若：電泳圖呈現(xiàn)干凈、光滑的單一一條帶，沒有拖尾現(xiàn)象，則說明DNA的完整性很好?？捎糜诤罄m(xù)PCR分子生物學操作。若：電泳圖有拖尾現(xiàn)象，不止單一一條帶，則DNA完整性不是很好，用于后續(xù)實驗操作效果較差。,DNA完整性良好,國內外相關文章,烏桕基因組DNA提取方法研究,張帥王曉光鄧先珍羅治建程軍勇盧小三【摘要】：以改良CTAB法和SDS法提取烏桕基因組DNA,對提取條件進行了正交試驗,優(yōu)化出烏桕基因組DNA提取的適宜條件,采用紫外分光光度檢測、瓊脂糖凝膠電泳分析及限制性內切酶進行了檢測。結果表明:改良CTAB法的A1、B2、C2、D2組合提取的基因組DNA純度高,無拖尾現(xiàn)象,OD260/280值在1.82.0,OD260/230在2.0。,【作者單位】：華中農業(yè)大學;湖北省林業(yè)科學研究院;【分