丙型肝炎病毒感染的抗體應(yīng)答及其免疫測定

丙型肝炎病毒感染的抗體應(yīng)答及其免疫測定,衛(wèi)生部臨床檢驗中心李金明,?,丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)是輸血后肝炎的主要病原；目前的檢測手段主要是采用ELISA方法檢測獻血員血中的抗HCV抗體；HCV感染者血循環(huán)中存在針對HCV不同蛋白的抗體，且具體針對某種蛋白的抗是否出現(xiàn)、出現(xiàn)的時間、持續(xù)時間長度均有所差異，因此，ELISA測定時所使用的包被抗原必須全面，才能有效地檢出所存在抗體；但在實際工作中，由于不同的抗HCVELISA試劑盒生產(chǎn)廠家所使用HCV抗原的來源、質(zhì)量及包被濃度各有差異，使得在測定中對同一份樣本所測定的結(jié)果有時會出現(xiàn)很大的差異，尤其是對較弱陽性的樣本或僅出現(xiàn)針對HCV單個蛋白成份的抗體的樣本。,丙型肝炎病毒的分子生物學(xué),HCV為一有包膜呈球形的正單鏈RNA病毒;HCV的基因組全長約9.4kb，由一過長的5非編碼區(qū)（5-noncodingregion,5NCR）、大的約9033個核苷酸（nt）開放讀碼框架(openreadingframe,ORF)和一含poly（A）或poly（U）的3非編碼區(qū)（3NCR）尾部三部份組成(圖1),丙型肝炎病毒的分子生物學(xué),丙型肝炎病毒的分子生物學(xué),通常采用基因工程方法，表達上述結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白作為包被抗原來建立抗HCV檢測的ELISA方法。HCV的5NCR的保守性最好，故RTPCR檢測HCVRNA的引物設(shè)計多選用該區(qū)域。,丙型肝炎病毒的分子生物學(xué),HCV為一具有很高變異率的不均一病毒株。其在復(fù)制過程中所依賴的RNA聚合酶為一容易產(chǎn)生錯配傾向（error-prone）的RNA依賴的RNA聚合酶。同許多其它RNA病毒一樣缺乏修補機制，使得不精確復(fù)制產(chǎn)物不能得到修補，從而出現(xiàn)較多的錯配，表現(xiàn)出較高的變異率。多次復(fù)制和變異的結(jié)果將導(dǎo)致多種不同變異株的產(chǎn)生，表現(xiàn)為HCV株間的不均一性或差異性。,丙型肝炎病毒的分子生物學(xué),JensBukh對所有的HCV序列比較和分析后認為：（1）HCV至少可分為9個主要基因型和30多個基因亞型；（2）各基因型間核酸水平的同源性為65.7%68.9%，各亞型間為76.9%80.1%，同亞型間為90.8%99.0%，符合基因分型原則；（3）已證實采用部份基因組區(qū)段和全基因組序列進行基因分型具有很好的一致性，但除E1和NS5b外，其它各區(qū)的代表性并不完全，因此建議E1和NS5b是將來進一步基因分型的最好選擇片段；（4）在眾多的基因分型方法中，均各有其優(yōu)缺點，唯一可信而又可用于鑒定新的基因型的方法，就是選擇特定的HCV基因區(qū)段特別是E1區(qū)進行測序分析。,丙型肝炎病毒的分子生物學(xué),HCV基因型的分布有明顯的地區(qū)差異。1型和2型呈廣泛分布，1a和1b是北美、南美和歐州的主要株型，而1b是大多數(shù)亞州國家的主要株型；3型主要分布尼泊爾、泰國、英國、澳大利亞、芬蘭及新西蘭等國；4型是中北非州國家的主要株型；5型則是南非國家的主要株型；6型在香港和越南占重要比例；7、8、9型均從越南病例中發(fā)現(xiàn)。在我國以1b和2a為主要株型，其它基因型少見。,HCV感染的免疫應(yīng)答的特點,（1）HCV作為單鏈RNA病毒，復(fù)制活性較低，感染過程中誘生、干擾素的能力弱于雙鏈RNA病毒；（2）HCV的變異主要在包膜蛋白編碼區(qū)，機體的免疫作用可加速這種選擇性變異并很快在受染者體內(nèi)出現(xiàn)準種及主要株型的轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)出多相免疫應(yīng)答反應(yīng)；（3）由于HCV核酸具有感染性，因此可阻止病毒在細胞間傳播的抗體、干擾素對HCV核酸來說將無能為力；（4）HCV在感染者體內(nèi)滴度較低，雖然能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，但在多數(shù)情況下可能不足以誘導(dǎo)有效的病毒清除反應(yīng)。,機體對HCV感染的抗體應(yīng)答,對非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體應(yīng)答對衣殼蛋白的抗體應(yīng)答對包膜蛋白的抗體應(yīng)答（一般認為C區(qū)和NS4區(qū)蛋白能誘導(dǎo)機體較強的抗體應(yīng)答）,對HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體應(yīng)答（1）,HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的產(chǎn)物NS2、NS3、NS4和NS5四種蛋白，除NS2外其它均能有效地誘導(dǎo)HCV感染者的抗體應(yīng)答?？筃S3抗體的出現(xiàn)明顯早于其它抗體，與抗NS4和NS5抗體不同的是，其可能是構(gòu)象依賴性的，因為使用NS3的合成多肽不能檢出相應(yīng)的特異性抗體。而NS4區(qū)則含有至少兩個免疫優(yōu)勢序列位點，抗原性較強，絕大多數(shù)HCV感染者能產(chǎn)生針對該區(qū)C1003的抗體反應(yīng)。,對HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體應(yīng)答（2）,當HCV感染者抗NS3和抗NS4抗體陰性時，針對NS5區(qū)病毒RNA聚合酶的抗體反應(yīng)可為陽性，并且其血清轉(zhuǎn)換要早于其它抗原。在慢性HCV感染者中有79的病人出現(xiàn)對該區(qū)的抗體反應(yīng)。由于NS5區(qū)的這些抗體應(yīng)答特征，它已被用于第三代ELISAHCV診斷試劑中，試圖增加診斷的敏感性和特異性。由于非結(jié)構(gòu)蛋白均在細胞內(nèi)產(chǎn)生，在細胞內(nèi)即完成其生物學(xué)功能。因此，機體對這些蛋白產(chǎn)生的抗體無保護作用，除了作為HCV感染的指標外，其是否通過諸如免疫復(fù)合物、抗體依賴的細胞毒作用等方式參與HCV或缺陷顆粒的清除以及肝內(nèi)、肝外組織免疫損傷過程尚不清楚。,對HCV衣殼蛋白的抗體應(yīng)答,HCV衣殼蛋白含有至少兩個主要位點，一是在523位氨基酸殘基之間，另一在3974位之間，它能誘導(dǎo)HCV感染者產(chǎn)生較早、較持久的抗體應(yīng)答。對該區(qū)抗體應(yīng)答的生物學(xué)意義可能與人體對非結(jié)構(gòu)蛋白抗體應(yīng)答的意義相同。,對HCV包膜蛋白的抗體應(yīng)答免疫保護與免疫逃避（1）,HCV的包膜糖蛋白具有高度的可變性，這種變異的根源在于HCV對機體免疫系統(tǒng)的作用所產(chǎn)生的免疫逃避。由于包膜蛋白快速變異導(dǎo)致的準種、多基因型以及基因型轉(zhuǎn)換等產(chǎn)生的免疫逃避，使得人們難以確定抗包膜蛋白抗體是否即是HCV中和抗體。對HCVE1及E2區(qū)以及產(chǎn)物多肽的深入研究發(fā)現(xiàn)：該區(qū)編碼的糖蛋白的變異不僅在HCV持續(xù)感染中起重要作用，同時也是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的抗原決定簇所在部位。,對HCV包膜蛋白的抗體應(yīng)答免疫保護與免疫逃避（2）,在包膜蛋白E2中有兩個高變區(qū)（HVR）即HVR1和HVR2。因在HCV感染者中未測出HVR2多肽特異性抗體，因而認為其在HCV的體液免疫反應(yīng)中不是一個主要抗原。而HVR1具有良好的抗原性，能有效的誘導(dǎo)機體的抗體應(yīng)答。目前普遍認為針對HVR1區(qū)的抗體具有中和抗體的作用，但這種保護作用是有限的、暫時的、高度特異性的。,對HCV包膜蛋白的抗體應(yīng)答免疫保護與免疫逃避（3）,因為HCV的免疫逃避使得HCV的基因型發(fā)生改變，進而改變抗原表型，以逃避機體特異性中和抗體的清除作用。新出現(xiàn)HCV株又刺激機體產(chǎn)生新一輪免疫反應(yīng)，于是，在機體的免疫壓力下，新HCV株又開始新一輪免疫逃避變異。循環(huán)往復(fù)，體現(xiàn)了HCV的免疫逃避和機體反逃避的相互作用。結(jié)果表現(xiàn)為HCV感染的持續(xù)存在。在免疫血清學(xué)上表現(xiàn)為在慢性HCV感染中有極高的特異性IgM抗體檢出率。也是許多HCV感染者體內(nèi)HVR1多肽抗體與HCV病毒血癥并存的原因。,HCV感染的免疫測定,HCV感染的免疫測定最廣泛的是抗HCV的檢測，多采用ELISA方法篩檢，重組免疫印跡試驗（Recombinantimmunoblottingassay,RIBA）進行確認?？笻CVELISA和RIBA檢測方法的建立的基礎(chǔ)是HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白或多肽抗原重組表達及體外合成的成功，并經(jīng)歷了第一代、第二代和第三代試劑的發(fā)展過程。,用于抗HCVELISA測定的抗原,有兩類，一類為基因工程重組抗原，其優(yōu)點是覆蓋抗原位點多，抗原抗體反應(yīng)強，如C33C。另一類是合成肽抗原，其優(yōu)點是易于純化，試劑特異性較好，缺點是合成肽抗原由于分子量較小，缺乏空間構(gòu)型決定簇，難免會造成漏檢。,第一代抗HCV檢測試劑,第一代抗HCV檢測試劑是在1989年美國Chiron公司Choo等首先克隆的HCV基因組5-1-1片段的基礎(chǔ)上建立的。他們將包括5-1-1在內(nèi)的一個克?。–-100）與編碼人超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）的基因片段融合，在酵母細胞中表達了可用于檢測抗HCV抗體的C100-3抗原，為C100與SOD的融合蛋白。1990年美國Ortho和Abbott公司用C100-3抗原生產(chǎn)了第一代抗HCVELISA試劑盒，并廣泛應(yīng)用于獻血員的篩檢及臨床HCV感染的檢測。,第一代抗HCVELISA診斷試劑的缺陷,（1）特異性不高。常發(fā)現(xiàn)有假陽性，部份是由于患者血清中存在針對融合蛋白中的SOD的抗體；類風濕因子（Rheumaticfactor,RF）陽性血清標本，也有很大一部份為抗C100-3抗體陽性。（2）靈敏度低?？贵w檢出時間晚，大多數(shù)病人在HCV感染46個月后才能產(chǎn)生抗C100-3抗體，有少數(shù)要到1年以上甚至始終不出現(xiàn)抗C100-3抗體。C100-3靈敏度低可能與HCV存在不同亞型以及C100-3只占HCV基因組編碼蛋白的一小部份等因素有關(guān)。,第一代抗HCV的RIBA確認試劑,1990年Chiron/Ortho公司聯(lián)合研制了第一代RIBA試劑作為抗HCV的確認試劑，其使用兩種HCV抗原即C100-3和5-1-1分別固定在硝酸纖維素膜上。這兩種抗原都是與SOD的融合蛋白。檢測時，C100-3和5-1-1帶均為陽性則判為陽性，其中之一為陽性則判為不確定，兩者均陰性者判為陰性。,第二代抗HCVELISA檢測試劑,隨著對HCV研究的不斷深入，HCV的特異性核心區(qū)抗原P22（C22）和NS3區(qū)抗原C33C表達成功，經(jīng)與C100-3抗原對比檢測發(fā)現(xiàn)，C22和C33C抗原的早期診斷能力均優(yōu)于C100-3抗原，并提高了檢測的靈敏度和特異性。于是以包被核心和NS3區(qū)抗原為主的第二代抗HCVELISA試劑盒應(yīng)運而生，不同的廠家抗原的包被模式各有不同，主要有以下二種：（1）C22C33C；（2）C22和C200（C100C33C）。,第二代抗HCVRIBA試劑,第二代RIBA試劑（RIBA2）含有4種抗原成份，即C100-3、5-1-1、C33C（NS3區(qū)）和C223（C區(qū)）。第二代RIBA試劑增加了核心區(qū)和NS3區(qū)抗原，檢測的敏感性和特異性較第一代RIBA有所提高。,第三代抗HCVELISA試劑,其改進主要有：（1）根據(jù)各種HCV抗原在檢測中所起的作用及其診斷價值調(diào)整了各組份在試劑盒中的比例，優(yōu)化了試劑盒的組裝工藝。由于C33C無論是在抗HCV早期診斷及提高檢測靈敏度上都有重要價值，而C22中的HCV核心N端保守區(qū)域易產(chǎn)生非特異性交叉反應(yīng)，因此，在第三代試劑中，核心抗原比例相對下降，而相應(yīng)增加了C33C的比例；（2）隨著基因重組技術(shù)發(fā)展，對一些重要抗原采用更好的表達系統(tǒng)表達，對所采用的基因片段進行重新定位；利用各種先進的生產(chǎn)工藝，使原料抗原活性更強，增加了檢測靈敏度，同時減小了非特異性；（3）發(fā)現(xiàn)了NS5區(qū)的血清學(xué)意義，增加NS5區(qū)抗原作為包被抗原。,第三代抗HCVRIBA試劑（RIBA3）,RIBA3所用抗原由核心區(qū)的C22、NS3區(qū)的C33C、NS4區(qū)的5-1-1和C100及NS5抗原組成，較之第二代試劑增加了NS5。RIBA陽性，可充分說明病人的感染性及肝病的存在。RIBA不確定結(jié)果有多種解釋：（1）所有對RIBA2中的5-1-1、C1003或RIBA-3中的NS5的單獨反應(yīng)都代表假陽性；（2）RIBA2中核心及NS3的不確定結(jié)果可能代表真陽性，其結(jié)果可被靈敏度更高的確認實驗或E2的gp70抗原檢測所證實；（3）在免疫自限性的高危人群中，不確定的RIBA結(jié)果有較大差異，但其中絕大部份都有病毒血癥及肝炎存在。,三代抗HCVELISA測定試劑的比較,試劑包被抗原窗口期敏感性特異性第一代C100334個月8090假陽性較高第二代C223、C33C812周90以上特異和C1003第三代C223、C33C610周95特異性更好和NS5,抗HCVELISA和RIBA診斷試劑的不足,在低危人群中仍發(fā)現(xiàn)大量的不確定和假陽性結(jié)果，再則仍有較長的“窗口期”。第三代試劑顯著增加了NS3抗原成份，同時相應(yīng)減少了核心區(qū)抗原成份，這在一定程度上提高了檢測靈敏度及降低了低危人群的非特異反應(yīng)。但是，核心區(qū)抗原的減少程度把握不好的話，有可能會導(dǎo)致漏檢的發(fā)生。此外，由于這些試劑所使用HCV抗原只是病毒的部份重組多蛋白或合成肽抗原，加之，固相對這些蛋白或多肽的吸附能力的局限性，使得固相上能捕獲抗體的抗原決定基的數(shù)量有限，從而影響測定的敏感性。,HCV融合蛋白研究進展,近來，美國Chiron公司構(gòu)建表達了一個所謂的MEFA-6融合蛋白，其包含兩拷貝的主要核心和NS5決定基、一個單拷貝主要E1和E2線性決定基和一個從NS4（5-1-1）衍生的單拷貝的基因型1、2和3特異的決定基，由于螺旋酶區(qū)具有很強的免疫原性，故又將大部份NS3區(qū)包含在內(nèi)。這種融合蛋白囊括了HCV基因組7個功能區(qū)中的所有主要的免疫決定基（圖2）。,MEFA-6融合蛋白與HCV基因組的關(guān)系,MEFA-6融合蛋白的優(yōu)點,使用這種蛋白建立的抗HCV化學(xué)發(fā)光測定方法表現(xiàn)了很好的測定靈敏度和特異性，測定敏感性較使用NS3-NS4-核心（C25）區(qū)融合蛋白的免疫測定方法高24倍。這種融合蛋白的優(yōu)點是:(1)增加了重組抗原上主要決定基的數(shù)量，同時減少了不必要的氨基酸的數(shù)量，這樣就提高了暴露在外的決定基的比例；（2）重復(fù)性決定基序列的存在降低了由于抗原結(jié)合于固相所致的空間位阻；（3）MEFA抗原更容易純化。大多數(shù)酵母和大腸桿菌細胞內(nèi)蛋白非常難溶，而MEFA6蛋白主要含親水性決定基，因此，較通常的重組多肽具有更好的可溶性，更易于純化。,目前抗HCVELISA檢測所存在的問題,目前抗HCV檢測ELISA試劑盒均采用HCV的基因工程或合成多肽抗原（核心區(qū)、NS3、NS4和NS5等）包被固相，以間接法進行測定；由于上述HCV抗原的組合、來源及用量等方面的差異，可能會造成在臨床上使用不同試劑生產(chǎn)廠家的ELISA試劑盒的測定結(jié)果出現(xiàn)較大的差異，漏檢現(xiàn)象嚴重，用于獻血員血液篩