核酸檢測ppt課件

核酸檢測在血液篩查中的應(yīng)用,深圳市血液中心,1,ppt學(xué)習(xí)交流,血液篩查是否需要進(jìn)行核酸檢測,2,ppt學(xué)習(xí)交流,無償獻(xiàn)血的新動態(tài),“定期無償獻(xiàn)血者是低危的獻(xiàn)血者”，但是“以體檢為目的定期無償獻(xiàn)血者是高危獻(xiàn)血者”而且這部分人群的獻(xiàn)血隊伍正在擴(kuò)大。這部分人群窗口期的機(jī)率高于其他人群。因為在他們中間高危的傳播行為經(jīng)常發(fā)生。經(jīng)過治療后的HBsAg轉(zhuǎn)陰，ELISA方法檢測陰性的獻(xiàn)血者。,3,ppt學(xué)習(xí)交流,NAT與ELISA互補(bǔ),病毒變異免疫靜默期實驗操作失誤病毒感染的窗口期,4,ppt學(xué)習(xí)交流,病毒檢測窗口期,5,ppt學(xué)習(xí)交流,血篩用NAT試劑與臨床用的不同,6,ppt學(xué)習(xí)交流,目的和要求不同,定性與定量臨床使用核酸檢測主要目的是定量監(jiān)測，進(jìn)行療效分析。血篩用于病原體的定性篩查靈敏度和特異性臨床在漏檢與誤差之間更重視誤差血液篩查用核酸目的是保證用血安全，更重視漏檢質(zhì)控要求不同臨床用與血液篩查用質(zhì)控要求也不同。臨床試劑以定量準(zhǔn)確和防止誤報為質(zhì)控目標(biāo)血篩用以防止漏檢為主要目的陽性率也不同臨床更多的陽性；血篩更多是陰性對自動化要求不同臨床更多用于病人,單人份檢測,標(biāo)本量少血篩更多用于正常人，因此檢測量不同，對自動化的要求也不同,7,ppt學(xué)習(xí)交流,血篩用NAT平臺的要求,靈敏度HBV10IU/ml；HCV、HIV200IU/ml特異性核酸的特異性高，幾乎沒有方法學(xué)假陽性但要防止污染內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對照）為避免假陰性，要求每管陽性質(zhì)控自動化大規(guī)模、高通量,8,ppt學(xué)習(xí)交流,關(guān)于靈敏度的幾個問題,廠家宣傳的靈敏度均指單人份檢測，而非推薦pooling方案的實測靈敏度實際應(yīng)用靈敏度=宣傳靈敏度pooling數(shù)IU才有可比性：WHO標(biāo)準(zhǔn)品以及國家一級標(biāo)準(zhǔn)品均以IU為單位HCV、HIV窗口期濃度高，因此對靈敏度要求較低。美國FDA要求，HCV、HIV5000IU/ml能在pooling方案中被檢出HBV的窗口期標(biāo)本在30-300IU/ml之間，因此對靈敏度要求高低于靈敏度也有檢出的可能，這與取樣幾率有關(guān),9,ppt學(xué)習(xí)交流,血液篩查常用的NAT技術(shù),10,ppt學(xué)習(xí)交流,核酸提取均使用磁珠法,磁珠提取的原理：將磁珠上標(biāo)記特異性吸附核酸的物質(zhì)特異性吸附核酸，并通過磁分離技術(shù)將病毒核酸從裂解液中提取出來步驟：裂解吸附洗滌洗滌洗滌洗脫優(yōu)點：磁珠提取特異性高，受標(biāo)本因素影響小，靈敏度高易于實現(xiàn)自動化缺點：成本較高、并需要一定的儀器(半自動、全自動)。完全手工工作量太大,11,ppt學(xué)習(xí)交流,實時熒光定量PCR技術(shù)原理,所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。,12,ppt學(xué)習(xí)交流,實時熒光優(yōu)點,特異性好引物、探針雙重保證特異性方法學(xué)假陽性很少擴(kuò)增檢測同時進(jìn)行，速度快，且不對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，不易污染熒光檢測靈敏度高羅氏第二代的NAT試劑也是使用實時熒光檢測,13,ppt學(xué)習(xí)交流,內(nèi)標(biāo)設(shè)計原理,內(nèi)標(biāo)為一已知低含量的與模板擴(kuò)增效率相似的一段DNA片段，將它加入PCR反應(yīng)液中，與模板共同擴(kuò)增，以反應(yīng)每管真實的擴(kuò)增情況，如果內(nèi)標(biāo)和樣品都未擴(kuò)增出結(jié)果，則表示該管擴(kuò)增無效，應(yīng)重新做。,14,ppt學(xué)習(xí)交流,內(nèi)標(biāo)的作用：避免假陰性,內(nèi)標(biāo)的種類：同源、異源內(nèi)標(biāo)的作用：真實反應(yīng)擴(kuò)增效率避免假陰性：假陰性是目前血液篩查中最重視的問題之一，內(nèi)標(biāo)全程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控質(zhì)控,15,ppt學(xué)習(xí)交流,核酸檢測中遇到的問題與解決方案,16,ppt學(xué)習(xí)交流,人員素質(zhì)和清潔很重要,血篩用NAT對低濃度要求太高，高靈敏度的試劑操作對人員要求高，同樣的平臺不同的實驗員有很大的差距。平臺建立初期會有較大問題對人員素質(zhì)要求與自動化程度成反比實驗室及儀器清潔很重要由于少有高濃度標(biāo)本，因此大面積的污染不易發(fā)生。但由于試劑靈敏度高，如不隨時注意清潔，污染有積累效應(yīng)，會出現(xiàn)散發(fā)性樣本污染，引起假陽性,17,ppt學(xué)習(xí)交流,采血樣管的處理,玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。異硫氰酸胍鹽(Guanidinethiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活。,18,ppt學(xué)習(xí)交流,標(biāo)本匯集,利用STAR工作平臺,編制匯集軟件。合理的Pooling方案,19,ppt學(xué)習(xí)交流,Pooling方案,靈敏度因素檢出血液中最低的病毒含量與標(biāo)本匯集數(shù)量呈正比成本因素試劑價格以test為單位，檢測單位成本與pooling方案有關(guān)檢測標(biāo)本量及檢測時間因素擴(kuò)增檢測量=提取量3(HBV、HIV、HCV)與儀器密切相關(guān),20,ppt學(xué)習(xí)交流,影響靈敏度因素,Pooling方案內(nèi)標(biāo)的濃度標(biāo)本的加樣量磁珠的量和混勻模板制作過程的損失和提取量,21,ppt學(xué)習(xí)交流,批質(zhì)控的選用及設(shè)定,使用低濃度樣本為批陽性質(zhì)控由于有內(nèi)標(biāo)進(jìn)行每管陽性質(zhì)控，因此批陽性質(zhì)控主要目的是監(jiān)控實驗細(xì)微的系統(tǒng)誤差。因此陽性質(zhì)控濃度選擇要低過低的質(zhì)控會影響工作，因此不宜使用最低靈敏度濃度建議靈敏度的3-5倍較好多陽性和陰性質(zhì)控不宜固定位置，最好隨機(jī)分布由于有內(nèi)標(biāo)，多陽性質(zhì)控偶有個別出現(xiàn)問題，實驗結(jié)果也有保證,22,ppt學(xué)習(xí)交流,內(nèi)標(biāo)與結(jié)果的判定,內(nèi)對照（IC）使質(zhì)控成為每管質(zhì)控使用雙免熒光，保證內(nèi)對照和樣本反應(yīng)條件絕對一致競爭性設(shè)計，保證受影響因素一致結(jié)果判斷原則：樣本檢測陽性，無診IC情況均報陽性樣本檢測陰性：內(nèi)對照陽性，可以報陰性結(jié)果內(nèi)對照陰性，需要復(fù)檢通過軟件自動判斷，但建議要人工復(fù)核,23,ppt學(xué)習(xí)交流,核酸實驗室管理軟件,在實驗室管理軟件的基礎(chǔ)上增加核酸檢測的管理模塊，實現(xiàn)計算機(jī)管理,檢驗結(jié)果自動控制。,24,ppt學(xué)習(xí)交流,NAT與ELISA檢測的配合,1同步檢測2先做常規(guī)檢測，再做核酸檢測,25,ppt學(xué)習(xí)交流,自動化要求,保證質(zhì)量核酸檢測對技術(shù)要求高，特別是血篩用對靈敏度要求更高，所以自動化保證質(zhì)量的持續(xù)性進(jìn)入計算機(jī)管理系統(tǒng)由于標(biāo)本多，還要進(jìn)行pooling。為便于管理，減少人為錯誤，最好使用全自動工作站，這樣POOLING號、標(biāo)本號都統(tǒng)一自動記錄，不易搞錯提高工作效率降低工作強(qiáng)度,縮短實驗時間,26,ppt學(xué)習(xí)交流,自動化的進(jìn)程,27,ppt學(xué)習(xí)交流,今后面臨的問題,28,ppt學(xué)習(xí)交流,降低檢測成本,實驗室建設(shè)成本人員成本管理成本設(shè)備成本(各廠家的設(shè)備是否兼容，兼容性強(qiáng)的設(shè)備、試劑銷路好)試劑成本質(zhì)量成本,29,ppt學(xué)習(xí)交流,合理地進(jìn)行集中化檢測,提高檢測質(zhì)量降低檢測成本集中的區(qū)域要考慮標(biāo)本運(yùn)送時間。,30,ppt學(xué)習(xí)交流,標(biāo)本處理,標(biāo)本留樣和處理：也是核酸檢測質(zhì)量控制體系中的重要環(huán)節(jié)，否則在檢測之前病毒核酸已降解，造成假陰性檢測結(jié)果。臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作規(guī)范臨床用于RNA(如HCVRNA)擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后必須在1小時內(nèi)分離血清。全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范用于核酸定性檢測時，采集的抗凝全血應(yīng)在48h內(nèi)分離PBMC和血漿，否則應(yīng)在2448h內(nèi)分離血漿和血細(xì)胞。,31,ppt學(xué)習(xí)交流,試劑的穩(wěn)定性,試劑的靈敏度試劑內(nèi)標(biāo)的最佳標(biāo)準(zhǔn)試劑與全自動工作站的磨合,32,ppt學(xué)習(xí)交流,完善實驗室管理,技術(shù)要求更高操做要求更專業(yè)