【畢業(yè)學位論文】來源于橄欖綠鏈霉菌A1的木聚糖酶XYNB的分子改良博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 博士學位論文 來源于橄欖綠鏈霉菌 木聚糖酶 分子改良 1 博 士 研 究 生：楊浩萌 指 導(dǎo) 教 師：姚 斌 研究員 申請學位類別：理學博士 專 業(yè) ：生物化學與分子生物學 研 究 方 向：酶的分子生物學 培 養(yǎng) 單 位：研究生院 飼料研究所 提交日期 2006 年6 月 1 006 中國農(nóng)業(yè)科學院 博士學位論文評閱人、答辯委員會名單表 論文題目 來源于橄欖綠鏈霉菌 木聚糖酶 分子改良 論文作者 楊浩萌 專 業(yè) 生化與分子生物學 研究方向 酶的分子生物學 指導(dǎo)教師 姚 斌 培養(yǎng)單位 （研究所、 中心） 飼料所 姓名 職稱 碩（博）單 位 專 業(yè) 簽 名 宋未 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 首都師范大學生物學院分子生物學 文華安 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國科學院微生物研究所 微生物學 評 閱 人 李 俊 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo)中國農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所微生物學 答辯 主席 范云六 研究員 院士 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 分子生物學 吳乃虎 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 分子生物學 錢世均 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國科學院微生物研究所 酶分子生物學 宋 未 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 首都師范大學生物學院 分子生物學 莫湘筠 教授級高工 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 酶工程 張志芳 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 分子生物學 伍寧豐 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 微生物學 答 辯 委 員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 會議記錄（秘書） 論文答辯時間地點 農(nóng)科院飼料所 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學院或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學院有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 摘 要 木聚糖酶可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖,內(nèi)切 糖苷鍵，是一類重要的半纖維素酶。木聚糖酶在造紙、飼料、食品等行業(yè)和能源科學上都有著廣泛的應(yīng)用前景。來源于橄欖綠鏈霉菌（ 1 的木聚糖酶 一種性質(zhì)優(yōu)良的木聚糖酶，具有高比活性，抗胃蛋白酶和胰蛋白酶，已在飼料中作為添加劑應(yīng)用。但該酶的熱穩(wěn)定性一般,在應(yīng)用上存在不足。 本研究從提高該酶的熱穩(wěn)定性入手，通過定點突變和 方法對木聚糖酶行定向改良，將突變酶在畢赤酵母中表達純化并對其酶學性質(zhì)進行分析，以確定突變效果。同時，對該酶的催化殘基、影響最適 因素也做了一定的分析。 通過定點突變的方法，獲得了熱穩(wěn)定性有所提高的突變酶 40E、B。其中， 突變酶理5 變酶在70處理10 穩(wěn)定性是 ；增加二硫鍵的突變酶 0的半衰期由 3 高到9 基端替換獲得的融合酶 穩(wěn)定性較 70的半衰期由3 高到20 再對以上突變位點進行優(yōu)化組合，獲得了突變酶 基端替換結(jié)合二硫鍵的加入） ，最終比 0處理20 熱穩(wěn)定性提高了 ，半衰期由原來的 3 S 由于具有很好的熱穩(wěn)定性和 定性，在工業(yè)上有較好的應(yīng)用前景。 通過同源建模和定點突變，獲得突變酶 177F 和 變酶 177F 的酶活性幾乎完全喪失，推斷 177 是木聚糖酶 催化殘基。突變酶 最適由 .2，定性也向酸性 移，同時，最適溫度和熱穩(wěn)定性也有一定的提高,結(jié)果證實木聚糖酶 第46 位的氨基酸與其最適 相關(guān)， 并對酶的酸堿催化反應(yīng)起重要的作用。 通過 方法構(gòu)建木聚糖酶 突變體庫，定向篩選熱穩(wěn)定性有所提高的突變酶，從 700 個表達菌株中篩選出 變酶，將突變酶基因在畢赤酵母中表達，研究發(fā)現(xiàn)， 70的熱穩(wěn)定性較野生型酶 高了1倍。 又篩選到 變酶，它的最適溫度由原酶的 60下降到 40，熱穩(wěn)定性有所下降。初步建立了應(yīng)用 方法對木聚糖酶 行熱穩(wěn)定性的定向改良的研究體系，為今后木聚糖酶的進一步改良奠定了基礎(chǔ)。 本研究通過基因工程的手段，定向改良了木聚糖酶 熱穩(wěn)定性，推測出了木聚糖酶 催化殘基并分析了在催化反應(yīng)中起重要作用的氨基酸殘基。研究中獲得的一系列突變酶對研究木聚糖酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系起到了重要的作用，對指導(dǎo)木聚糖酶的進一步改良提供了良好的研究材料。 關(guān)鍵詞：木聚糖酶，熱穩(wěn)定性，最適 學性質(zhì)， 4is of of 4 of in 1 as as to is at of NA of to of pH 11Y、XS B by of 13D 40E 0 11Y .8 S (a 0 t 0 0 We to a S (of a S 0 , .0 0 S 50 S is in A of 87F、by 87F 177F of 87 177 to be 46D pH 46D .2 .2 pH 46D to 46D A is 46 is an to a NA A 00 as 0. A to of be to of he of by in in be of 錄 中文摘要 第一章 引言 一節(jié) 木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能木聚糖酶（分類及結(jié)構(gòu)區(qū)域聚糖酶的分類 聚糖酶的結(jié)構(gòu)區(qū)域 木聚糖酶的催化機制 木聚糖酶分子結(jié)構(gòu)與重要酶學性質(zhì)關(guān)系的研究進展 聚糖酶的催化殘基聚糖酶的熱穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定區(qū)（ 鹽橋（ 二硫鍵（ 芳香族氨基酸 蛋白質(zhì)表面精氨酸和脯氨酸的含量 一些保守的氨基酸 聚糖酶的最適 聚糖酶的底物結(jié)合區(qū) 問題與展望二節(jié) 組（技術(shù)簡介 組的原理 組技術(shù)的發(fā)展 組技術(shù)的成果 組的應(yīng)用前景 研究的目的和意義二章 木聚糖酶 穩(wěn)定性的分子改良 實驗材料種和質(zhì)粒 具酶 劑養(yǎng)基 要儀器 研究方法 聚糖酶 同源建模 變位點的確定變方法 序 兩步 序 突變試劑盒程序 突變引物組表達載體的構(gòu)建 )達載體( 任意突變酶基因) 達載體組木聚糖酶的表達及純化 在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達畢赤酵母中的表達 母感受態(tài)的制備 母細胞的轉(zhuǎn)化 化子的篩選 的基因在畢赤酵母中的表達檢測 酵罐水平重組酵 母的高細胞密度發(fā)酵 重組酶的 析 重組木聚糖酶的純化 聚糖酶活性的測定 酶活單位定義 木糖（準曲線的繪制聚糖酶活性測定的方法學性質(zhì)的分析與比較 木聚糖酶最適 定性的測定 木聚糖酶最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測定 金屬離子和相關(guān)化學 試劑對木聚糖酶活性的影響 木聚糖酶反應(yīng)初速度的測定聚糖酶 的測定 木聚糖酶比活性的測定準曲線的繪制 活性測定 纖維素酶活性的測定 木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的能力 結(jié)果 11Y 定點突變 同源建模及突變位點的確定點突變 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 重組木聚糖酶 表達純化 11Y 在大腸桿菌中的表達 11Y 在畢赤酵母中的表達 聚糖酶 純化 學性質(zhì)的分析與比較 40E 定點突變源建模及突變位點的確定 定點突變 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 重組木聚糖酶 40E 的表達純化 40E 酶學性質(zhì)的分析與比較聚糖酶 基端的替換 同源建模及突變位點的確定 木聚糖酶融合基因 構(gòu)建 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 重組木聚糖酶 表達純化 B 在大腸桿菌中的表達 B 在畢赤酵母中的表達 木聚糖酶 純化 學性質(zhì)的分析與比較 二硫鍵突變 同源建模及突變位點的確定變位點的引入 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 重組木聚糖酶 表達純化及二硫鍵的分析組木聚糖酶 表達純化 硫鍵的分析 學性質(zhì)的分析與比較 討論 11Y 定點突變13D、點突變聚糖酶 基端的替換 二硫鍵突變 小結(jié) 三章 木聚糖酶 化殘基的研究及最適 的分子改良 實驗材料 研究方法 變位點的確定 點突變方法 點突變 點突變 組表達載體的構(gòu)建 組木聚糖酶的表達及純化 學性質(zhì)的分析與比較 結(jié)果變位點的確定點突變組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 組木聚糖酶的表達及純化 大腸桿菌中的表達畢赤酵母中的表達 木聚糖酶 純化 酶學性質(zhì)的分析與比較4 討論 四章 木聚糖酶 實驗材料 種和質(zhì)粒 具酶、試劑、培養(yǎng)基及主要儀器 研究方法 驗設(shè)計的基因片段的擴增酶切切小片