動物細胞融合.ppt

1957年，日本科學家崗田善雄在培養(yǎng)動物細胞時加入失去活性的仙臺病毒，發(fā)現(xiàn)了細胞融合、產(chǎn)生具有兩個核的細胞。后來人們用此方法又成功地誘導了不同種動物的體細胞融合，并且能將雜種細胞培養(yǎng)成活，動物細胞融合技術隨之誕生?，F(xiàn)在這項技術已經(jīng)廣泛應用于細胞學、遺傳學、免疫學、病毒學等多種學科的研究工作中。,細胞A,細胞B,雜種細胞,滅活的病毒,物理法化學法,仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒,概念：通過誘導兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cellfusion）。如果2個不同的細胞進行融合，則稱為細胞雜交（cellhybridization）,融合細胞的類型：同核體（homokaryon）：由同一生物個體的細胞（基因型相同）所融合形成的融合細胞。異核體（heterokaryon）：來自不同基因型的細胞所融合形成的雜交細胞。,1.生物方法（病毒）病毒是最早采用的融合劑。某些病毒被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合。常用于誘導動物細胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等。用作融合劑的病毒必須事先滅活（紫外線或-丙內(nèi)酯），使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。,第二節(jié)誘導細胞融合的方法,用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖,仙臺病毒是最常用的病毒誘導融合劑。優(yōu)點：融合率較高、應用廣（對各種動物細胞都適宜）、容易培養(yǎng)（可在雞胚中大量繁殖）。病毒介導融合的缺點：不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降低；制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞后，可能會對細胞的生命活動產(chǎn)生干擾。,2.化學誘導融合化學融合劑主要有高級脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG可以促使細胞凝結(jié)、破壞互相接觸處的細胞膜的磷脂雙分子層，從而使相互接觸的細胞膜之間發(fā)生融合，進而細胞質(zhì)溝通，形成一個大的雙核或多核融合細胞。,影響PEG誘導融合效果的因素：分子量與濃度：分子大、濃度高的PEG，有利于融合，但毒性也隨之增大。一般用分子量PEG1000-4000，40%-60%PH:8.0-8.2誘導時間：長，效率高，但毒性增大、容易形成多核細胞溫度：38-40度,3.物理方法(離心，震動，電融合)最常用的是電融合法細胞在電場中排列成串、聚集成串珠狀，然后施加高壓電脈沖，促使細胞在相互接觸的細胞膜處產(chǎn)生穿孔，導致細胞之間的細胞質(zhì)連通，進而發(fā)生細胞融合。細胞電融合技術有許多優(yōu)點，如誘導細胞融合的頻率高，對細胞無毒害作用，操作簡便，可重復性好。,兩種親本細胞融合的混合物中可能有多種類型細胞，如：1)親本細胞2)同核體：同源細胞的融合體3)異核體：非同源的細胞的融合體4)多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體篩選的目的是為了獲得優(yōu)良的雜種細胞,第三節(jié)雜種細胞的篩選,融合細胞的篩選方法,1.利用細胞形態(tài)、大小、顏色差異篩選2.利用抗藥性篩選親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏感親本B：對卡那霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長,3.利用營養(yǎng)互補篩選：細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。,4.利用基因缺陷互補篩選最常用的是在親本細胞的嘧啶和嘌呤代謝途徑中引入缺陷突變來篩選雜交細胞，即HAT篩選系統(tǒng)。細胞合成核苷酸有2條途徑：從頭合成途徑和補救途徑。,阻斷從頭合成核苷酸途徑的物質(zhì)：次黃嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin，T)。HAT培養(yǎng)基：含有H、A、T的培養(yǎng)基,在HAT培養(yǎng)基上，細胞從頭合成核苷酸途徑被阻斷，只能利用補救合成途徑。在補救途徑中，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（簡稱HGPRT）和胸苷酸激酶（TK）起重要作用。HGPRT-和TK-的細胞不能增殖，但HGPRT-TK+與HGPRT+-TK-融合細胞則可以增殖。,鼠,人,X,TK-HGPRT+,TK+HGPRT-,鼠,人,鼠,人,鼠,人,TK+和HGPRT+,HAT,HAT,HAT,不分裂,不分裂,分裂,HAT篩選示意圖,第四節(jié)融合細胞的克隆化培養(yǎng),篩選出來的融合細胞仍屬于異質(zhì)性的細胞群，不完全是純系，需要進一步純化、獲得同質(zhì)性的細胞群。常用方法是克隆化培養(yǎng)。克隆化培養(yǎng)：培養(yǎng)單個雜交細胞、以得到遺傳特征相同而穩(wěn)定的雜種細胞系。,半固體培養(yǎng)法=平板培養(yǎng)單細胞在軟瓊脂（或者瓊脂糖）培養(yǎng)基上增殖后不能移動，形成集落。待細胞集落長到肉眼可見后，用吸管從瓊脂上挑出來(一般8-10天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進行繁殖。,2.有限稀釋法將細胞稀釋到100個/ml，理論上每0.01ml(10l)含有1個細胞。取0.01ml細胞液在培養(yǎng)板(如96孔板)的小孔中培養(yǎng)，則可獲得單個細胞形成的集落。1)取1.0ml5104/ml細胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1104/ml.2)取0.5ml1104/ml細胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1103/ml.3)取0.5ml1103/ml細胞液+4.5ml培養(yǎng)基稀釋，得100cells/ml.4)取0.01ml的100cells/ml細胞液于培養(yǎng)板小孔，加0.1ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)后得雜種細胞系。,3.顯微鏡操作法通過顯微操作分離雜交單細胞、分別單獨培養(yǎng)。4.蓋片分離法1)用釘錘于潔凈的橡膠上砸干凈蓋玻片；2)選擇碎塊、大小形態(tài)適用碎片；3)加培養(yǎng)液、進行細胞培養(yǎng)；4)倒置鏡下選細胞，挑出單細胞玻片；5)進行單個細胞培養(yǎng)。,5.熒光激活分離法用一種熒光激活細胞分類器（FluorescenceActivatedCellSorter，F(xiàn)ACS）分離雜交細胞。原理：將細胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個細胞的線形液滴，在激發(fā)光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號由光電倍增管接收，再結(jié)合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號并與預定的信號對比，根據(jù)細胞熒光強度及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。,第五節(jié)細胞融合技術的應用,動物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體，抑制抗原的作用；增加身體的抗體就可以提高機體的抗病能力?？贵w具有特異性，其特異性取決于抗原分子的決定簇?？乖瓫Q定簇：存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，一般由58個氨基酸或單糖或核苷酸殘基組成。,一、B淋巴細胞雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體,各種抗原分子具有很多抗原決定簇，不同抗原的決定簇數(shù)目不同，如白喉類毒素有8個，流感病毒有40多個?？乖瓫Q定簇大多存在于抗原的表面，但也有隱藏在抗原內(nèi)部?？贵w是由B淋巴細胞分化形成的漿細胞合成、分泌的。每一個B淋巴細胞在成熟的過程中只產(chǎn)生一種抗體。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞，因此，當機體受抗原刺激時，每種B淋巴細胞產(chǎn)生一種抗體（單一抗體），整個動物可以產(chǎn)生眾多不同的抗體（多克隆抗體）。用免疫動物生產(chǎn)、制備抗體效率低，且多克隆抗體應用有很多缺陷，分離這些不同的抗體極為困難。,選出一個合成一種專一抗體的細胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細胞經(jīng)增殖而形成的細胞群，即單克隆細胞。單克隆細胞合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。單克隆抗體具有理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合特異性強、質(zhì)量可控等優(yōu)點，用途：1醫(yī)學診斷試劑廣泛應用于酶聯(lián)免疫、放射免疫分析、免疫組化和流式細胞儀等技術。單克隆抗體促進了商品化試劑盒的發(fā)展，試劑盒靈敏度高、使用方便、快速，用于病原微生物抗原、腫瘤抗原、免疫細胞及其亞群的檢測，激素、細胞因子的測定。,2.食品安全的檢測食品中的毒素（如黃曲霉毒素）、有機農(nóng)藥的檢測。方便、靈敏,3蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質(zhì)（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。,4腫瘤的導向治療（生物導彈）化療、放療：無選擇性，副作用大把腫瘤單克隆抗體與抗癌藥物結(jié)合起來，就成為“生物導彈”。把這種抗體“導彈”注射到癌癥患者的血液中，它就會在患者體內(nèi)追蹤并附著于癌細胞上，然后與抗體結(jié)合的抗癌藥物殺傷和破壞癌細胞，而且很少損傷正常組織細胞。這種抗體“導彈”具有高度選擇性，對癌細胞命中率高、殺傷力強大、副作用小等優(yōu)點。,動物細胞融合技術為單克隆抗體的制備提供了個全新、高效的方法。1975年，G.Kohler（德國）和C.Milstein（阿根廷、英國雙國籍）把產(chǎn)生抗體的淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合，形成雜交瘤細胞，證明了這種細胞既有骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又有淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能。因此，這種雜交瘤細胞就能產(chǎn)生大量單一類型的高純度抗體，單克隆抗體。,GeorgesJ.F.Khler,CsarMilstein,NielsK.Jerne,1984年，G.Kohler、C.Milstein和NielsK.Jerne獲得Nobel獎，表彰他們關于免疫控制機制理論的研究以及開發(fā)制備單克隆抗體技術。,單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細胞(hybridomacell)，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術(hybridomatechnology）。,動物細胞融合技術為生產(chǎn)單克隆抗體過程,（1）免疫小鼠、制備B淋巴細胞,取6-8周齡Balb/C雌鼠，基礎免疫2周后，再靜脈加強免疫一次，3-5天后分離、制備B淋巴細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37)，并計細胞數(shù)和測定活力細胞。,（2）制備骨髓瘤細胞,收集骨髓瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37)，計數(shù)活力細胞(不少于90)。,（3）細胞融合,(1)按1：5-10混合B淋巴細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。(2)將1ml40的PEG液一滴滴加入細胞混合物中，在60秒內(nèi)加完，同時并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(3)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(4)于5分鐘內(nèi)慢慢加入20ml無血清培養(yǎng)液；此時細胞對機械損傷非常敏感，,HAT選擇：淋巴細胞及其融合細胞：不能生長，57天死亡；骨髓瘤細胞及其融合細胞：DNA從頭合成途徑被阻斷；HGPRT缺乏，DNA合成的補救途徑受阻，不能生長，57天死亡；淋巴細胞和骨髓瘤融合細胞：能生長,(5)離心(800轉(zhuǎn)/分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(6)取96孔板，每孔加50l，再加取等體積細胞懸液。(7)在CO2培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)；24h后更換成HAT選擇性培養(yǎng)液,（4）雜交瘤細胞的選擇和克隆化培養(yǎng),第一次抗體篩選：融合培養(yǎng)24h后更換成HAT選擇性培養(yǎng)液，雜交瘤細胞生長增殖、形成細胞群，再利用免疫學方法檢測其抗體合成。第二次抗體特異性篩選：從雜交瘤細胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞。,由于雜交瘤細胞的染色體不穩(wěn)定，需要進行3-5次克隆化培養(yǎng)，才可得到基因型穩(wěn)定、特異性抗體合成穩(wěn)定的雜交瘤細胞。,（5）克隆化培養(yǎng),二、T淋巴細胞雜交瘤生產(chǎn)干擾素、細胞因子T淋巴細胞在免疫系統(tǒng)中占有極重要的位置，在體內(nèi)能產(chǎn)生多種