【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）除草微生物禾長蠕孢的菌種改良與制劑的研究農(nóng)業(yè)微生物博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 博士學位論文 除草微生物禾長蠕孢的菌種 改良與制劑的研究 on of on of I 摘 要 化學防治雜草給農(nóng)業(yè)的發(fā)展做了較大的貢獻，但伴隨著環(huán)境污染、雜草抗性增加、農(nóng)產(chǎn)品安全等問題。因此開發(fā)新型環(huán)保型除草劑、減少化學除草劑的使用是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢。發(fā)展微生物除草劑，實現(xiàn)雜草的生物防治，可以大幅度減少 化學除草劑的使用，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 禾長蠕孢菌稗草?；停?f. 彎孢菌（ 中國水稻研究所雜草室從自然感病稗草上分離得到的兩株病原真菌，它們是稗草的生防潛力菌株。 稗草致病力強，但孢子產(chǎn)量低，而孢子產(chǎn)量高，但對稗草的致病力弱。本研究根據(jù)這兩個菌株的特性，采用原生質(zhì)體融合技術，將兩者優(yōu)良特性結(jié)合起來，培育出孢子產(chǎn)量提高、代謝產(chǎn)毒能力強、適 合工業(yè)化發(fā)酵的優(yōu)良工程菌株。并對探討該菌株的發(fā)酵產(chǎn)毒素工藝、毒素微乳劑的制備技術，調(diào)查融合菌株的毒素田間防治雜草效果。獲得以下主要結(jié)論： 1. 確定了禾長蠕孢和彎孢菌的原生質(zhì)體釋放最佳條件。 2% 溶壁酶 + 2% 蝸牛酶、 2% 纖維素酶 + 2%蝸牛酶分別為彎孢菌（ 禾長蠕孢菌（ 佳溶菌酶組合； 6 h、 24h。原生質(zhì)體經(jīng)過液體培養(yǎng)基再生后，獲得了較高的再生頻率， 原生質(zhì)體再生率分別為 、 2. 獲得 了較高的融合率。低濃度 氨酸溶液有利于彎孢菌與禾長蠕孢菌的原生質(zhì)體融合，其融合率為 10 10過對融合子生物學性狀的評價，篩選出四株產(chǎn)毒素提高的融合子，其中融合子 037 毒素 的合成能力較其親本 高了 34；溫室評價 間的融合子，獲得了兩株孢子產(chǎn)量和生防潛力提高的融合菌株 012、 053，其孢子產(chǎn)量較其親本 對稗草鮮重防效和干重防效分別提高了 3. 紋分析融合子與親本的親緣關系，驗證了融合子遺傳物質(zhì)偏親現(xiàn)象和融合過程中發(fā)生了遺傳重組。 4. 確定了融合子液體產(chǎn)毒素的搖瓶發(fā)酵條件為：菌株 037；培養(yǎng)基為馬鈴薯 200g，葡萄糖 30g，麩皮 20g,酵母膏 1g， g,g；菌絲體接種量 10。 5. 確定了融合子 037 粗毒素的 10微乳劑劑型配方： 10粗毒素 15助溶劑（ 8 9# +7% 5#） + 15% 乳化劑 （ 1# +9#） +2% 氮酮 58 水。該制 劑在大田條件下對丁香蓼、節(jié)節(jié)菜和水莎草的防治效果較好；結(jié)合低劑量化學除草劑（芐嘧磺隆 +二氯喹啉酸）復合使用，該制劑對稗草和鴨舌草的防治效果達到 80以上。 鍵詞 禾 長 蠕 孢 菌 稗 草 專 化 型 （ f. 彎孢菌 （ 原生質(zhì)體融合 微乳劑 稗草 (L.) he to of of of of to be to of of in of to of f. by of to to L to of th is to of by as as to of to to of to to in of as 1. as L % % 1 % % 6 h L 4 h 1. in a h L 1. 2. a 10- 3 1 L、 10- 4 3 L. 037, a 1. 3 L, a in of 012 053 ， 3. on of IV 4. 037 as 00 g/L, 0 g/L, 0 g/L, g/L, g/L, g/L as 0 as 5. 0% 0% 8% # + 7% # +# + #+ 2% 58% a as of , it 0%, 5%. f. L.) V 目 錄 第一章 文獻綜述 . 1 生物除草劑 . 1 體微生物防治雜草的潛力及研究進展 . . . 微生物天然產(chǎn)物防治雜草的潛力及研究進展 . .響微生物除草劑商品化的因素 . .草微生物分離與篩選 . .草微生物的菌種改良 . . 微生物除草劑劑型研究 . .題的意義與目的 . . .研究內(nèi)容和技術路線 . 13 究內(nèi)容 . 13 技術路線 . 14 第二章 原生質(zhì)體的融合及融合子的鑒定與評價 . 15 料與方法 . 15 料 . 15 驗方法 . 17 據(jù)分析 . 20 果分析 . 20 合親本的基本性狀 . 21 生質(zhì)體融合 . 24 合 子的 紋分析 . 31 合子對作物的安全性評價 . 35 論 . 35 第三章 融合子的液體發(fā)酵研究 . 38 料與方法 . 38 驗材料 . 38 驗方法 . 38 驗結(jié)果 . 44 絲生長培養(yǎng)基的篩選 . 44 體搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化 . 45 0L 發(fā)酵罐放大 試驗 . 47 酵液中毒素酸堿穩(wěn)定性試驗 . 49 論 . 50 第四章 禾長蠕孢粗毒素微乳劑劑型的制備及田間應用評價 . 52 料與方法 . 52 驗材料 . . 試驗方法 . .據(jù)分 析 . .驗結(jié)果 . 54 0粗毒素微乳劑的制備 . . . . . 毒素作用方式試驗 . .間除草藥效試驗 . .討論 . 64 第五章 全文結(jié)論 . 66 參考文獻 . 67 致謝 . 76 作者簡歷 . 77 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 植物根際有 害細菌 高效液相色譜 乳劑 鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基 隨機擴增多態(tài)性 國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 目前 ,對稻田雜草的防治主要依賴化學除草劑。但化學除草劑的長期使用 ,其殘留對作物的藥害時有發(fā)生 ,局部地區(qū)農(nóng)田和水環(huán)境被污染 ,雜草抗藥性生物型增多 ,給農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構成潛在威脅（李迪等， 2004）。而生物源除草劑以其資源豐富、毒性小、不破壞生態(tài)環(huán)境、殘留少、選擇性強、對非靶標生物和哺乳動物安全、環(huán)境兼容性好等優(yōu)點，正逐步引起人們的重視（ 付穎和葉非， 2002） 。 生物除草劑 微生物除草劑是指將本地流行的能快速繁殖的雜草病原菌活體或其具殺 (抑 )草毒性的 代謝產(chǎn)物（植物毒素），制成一定的劑型，在雜草易感病期間施用的雜草生防制劑。利用微生物防治雜草或者把它作為一種輔助手段用于雜草防治。通常包括利用活體微生物和利用微生物天然產(chǎn)物 2種方法 。 活體微生物防治雜草的潛力和研究進展 近 40 年來，利用活體微生物，主要是植物病原微生物（真菌、細菌、病毒）防治雜草有較多的報道。最常見的植物病原物是真菌，它可以直接穿透寄主表皮，進入寄主組織，代謝產(chǎn)生毒素，抑制雜草的生長。真菌也比病毒和細菌易于人工大量繁殖，制成孢子除草劑。病毒和細菌一般只能通過植物的傷口、或通過昆 蟲的媒介作用感染侵入，但自然侵入很難。利用活體微生物防治雜草分傳統(tǒng)的微生物防治法和應用微生物除草劑 2 種主要途徑，前者是從雜草的原產(chǎn)地引入寄生性和傳播能力均較強的病菌，在田間接種釋放引起目標雜草的病害流行，從而把雜草數(shù)量降低到危害閥值以下，通過天敵保持著一種動態(tài)平衡。該方法適用于防治水域、牧場等人為干擾較少的生境。成功應用這一途徑的著名事例是澳大利亞從歐洲引入銹菌（ 防治麥田粉苞燈苣（ .） 。 1971 年澳大利亞為了控制東南部雜草粉苞 燈苣而引進此菌，這種雜草嚴重危害了上百萬英畝的小麥和牧草。從意大利的維埃斯特（ 采集的這一菌株是澳大利亞粉孢苣的高毒力拮抗株，而且顯示了對粉孢苣的專一性（ 972;1973）。 1975 年，從意大利的埃博利 (集的兩株粉苞苣柄銹菌被引種到美國。兩年內(nèi)在加利福尼亞和俄勒岡州，這種真菌迅速傳播引起優(yōu)勢雜草群體的嚴重感染，同時在太平洋西北沿岸的另兩個州愛達華州和華盛頓州現(xiàn)在也可見到這種真菌的存在。另外對粉苞苣的形態(tài)學及其對銹病菌株的易感性也進行了描述。 為接種物是用飛機按每公頃接種量 2 克孢子粉進行撒播，在短期內(nèi)引起銹菌感染，被粉苞苣柄銹菌感染的粉苞苣顯著降低了植株生物量、花和種子的數(shù)量。該菌嚴重感染蓮座 (，能夠使植株在開花前死亡，而且當?shù)貧夂顥l件有利于該菌的侵染 ,使該雜草的死亡率達到 90 (， 1981; 986)。 1975 年藿香薊小尾孢 (從牙買加引種到夏威夷控制菊科的種植物是夏威夷的森林和牧場中最嚴重的雜草（陳勇強等， 1998;顧成波和趙長中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 文獻綜述 2 山， 2003）。 對該真菌的寄主范圍進行了 29 科 40 種代表植物的試驗，證實此真菌專性寄生于株。 從 1975 年 到 1976 年 5 月進行實驗，在這一地區(qū)的有利氣侯條件下，病原菌感染率很高，雜草群體在九個月內(nèi)從 80 降到 5。病害發(fā)生在夏威夷全區(qū)，但控制最好的地區(qū)是在海拔 范圍內(nèi)。 1988 年 新對該菌株進行了鑒定，確定為菊葉黑粉菌 (一有性世代的 名稱。 微生物除草劑，是將雜草的致病菌進行大量培養(yǎng)，制成標準化的制劑，象化學除草劑一樣，當雜草處于敏感生長階段時，于苗前或者苗后施用，使雜草病害流行，從而實現(xiàn)控制雜草的目的。該方法在短時間內(nèi)可有效地控制草害，適用于防治農(nóng)田、草坪、及公園中的雜草。近年來，微生物除草劑尤其是真菌除草劑的開發(fā)和研究獲得了突破性進展，已約有 80 種不同的侵染生物菌種被研究，防除約 70 種雜草。按照發(fā)展生物除草劑的標準，有望作為候選或已發(fā)展成生物除草劑的有 36 種，已經(jīng)使用或商品化或極具潛力的有 19 種（顧成波和趙長山， 2003）。真菌類有潛力的微生物主要集中在 9 個屬：盤孢菌屬 (鐮孢菌屬 (鏈格孢菌屬（ 尾孢菌屬 (疫霉屬 (柄銹菌屬 (葉黑粉菌屬(殼單孢菌屬 (核盤菌屬 (雖然首選的是那些可以引起致命性病害如炭疽病、萎焉病、枯萎病及葉斑病的種群，但其選擇范圍仍是相當廣泛的。細菌類主要是根際細菌，主要有 7 個屬：假單孢菌屬 (腸桿菌屬 (黃桿菌屬(檸檬酸細菌屬 (無色桿菌屬 (產(chǎn)鹽桿菌屬 (黃單孢桿菌屬 (陳勇強等， 1998）。表 1出部分已研究具有開發(fā)潛力的微生物除草劑菌株（付穎和葉非， 2002）。 其中，用于稻田稗草防治的主要菌株有內(nèi)臍蠕孢菌（ 突臍蠕孢菌（ ( ， 1990; ， 1997)、鏈格孢菌（ ， 1995) 、 平 臍 孢 屬 （ （ ， 2000 ） 、 彎 孢 屬（ 1990）、鐮刀菌屬（ 梨孢屬（ 長蠕孢屬（ 985）、旋孢腔菌屬（ 987）。 微生物除草劑成功商品化的例子，有 1981 年在美國被登記注冊的 它是棕櫚疫霉()制劑，用于柑橘園進行土壤處理防治莫倫藤 () （ 985; 1986）。 1972 年，從佛羅里達州里的感病死亡的莫倫藤植株上首次分離得到該菌。將它用于田間試驗中，處理后 10周，對莫倫藤防效達 96。在 1978 年和 1980 年使用過 桔園， 6 年后仍保持 95100的防效（ 1985）。 隨后， 登記（ 986; 986），它是美國阿肯色大學和 司開發(fā)的一種合萌盤長孢狀刺盤孢合萌?；?(f ，用于防除水稻及大豆田中的弗吉尼亞合萌。它的應用、貯藏和施用方式與一般苗后莖葉處理除草劑類似。 以引起幼苗的炭疽病，感染其莖、葉柄和小葉（ 1979）。在小規(guī)模的田間試驗中，用 理后幾周內(nèi)， 被接種的弗吉尼亞合萌幼苗 100被殺死。商品制劑大田常規(guī)使用防效在 90以上 (1973)，在 1982 1991 年的 10 年內(nèi)，每年美國稻田使用面積為 5 千到 1 萬公頃 (萬方浩和王韌， 1991)。 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 文獻綜述 3 表 1 1 具有開發(fā)成微生物除草劑的潛力菌種 名稱 防除對象 球炭疽菌 （ C 茼麻（ A. 平頭炭疽菌 C 大果田菁 （ S. 瓜類炭疽菌、圓盤孢 (C. 刺蒼耳 (.) 柑橘褐腐疫毒 (莫倫藤 ( ) 交鏈孢屬真菌 （ 決明 （ .） 核盤菌 （ 加拿大薊 （ L.) 百日草鏈格孢 (A 蒼耳 (粗鏈格孢 (曼陀羅 (柿子孢 (柿屬雜草 () 飛機草尾孢 (和鏈格孢菌 (具腺澤蘭 ( 刺盤孢屬炭疽病菌 （ f 毛單室藥草 (突臍蠕孢菌 （ 稗草 （ L.) 鏈孢霉 （ 穗狀狐尾藻 ( 高粱點霉 （ 千屈菜 （ 平臍蠕孢屬 菌 （ 扁葉臂形草 （ 磚紅鐮刀菌 （ 苘麻 （ A. 尖鐮孢 (f 合歡 (腐皮鐮孢霉 （ F. 南瓜屬雜 草 (尖鐮孢菌 （ F. f 大麻 (圓盤孢 （ 蒼耳 ( 旋孢腔菌 （ 1 2 葉期稗草 （ L.) 拉賓黑粉菌 (馬唐 (炭 疽 病 菌 （ 大麻 （ 炭疽 病 菌 （ f 卷莖蓼 （ .) 柄銹菌 （ 莎草 （ .） 鏈格孢 （ A. 、 尾孢菌 （ 、 尾孢菌（ C. 鳳眼藍 (炭疽菌 （ C. 圓葉牽牛 (叉梗孢 （ 馬齒莧 (平臍蠕孢 （ 牛筋草 (殼針孢 （ f 野燕麥 (中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 文獻綜述 4 由加拿大農(nóng)業(yè)調(diào)查研究所開發(fā)、 司于 1992 年商品化的一種長孢狀剌盤孢錦葵?；?(f 簡寫為 粉劑，用于防治圓葉錦葵、苘麻（ 1992）。該菌是 1982 年從錦葵屬雜草圓葉錦葵 (.)莖的炭疽病斑上分離得到的（ 1992）。其在可控環(huán)境條件下以 2 106 孢子 /30 以下、結(jié)露 20 小時以上的條件下噴灑接種于目標雜草，顯示了很好的效果，處理后 1720 天雜草全部枯死。在田間試驗條件下，用 6 107 孢子 /用后 48 小時內(nèi)降雨或結(jié)露 12 15小時，保持 20左右的冷涼天氣且在陰天的條件下防除雜草獲得成功。 我國也是世界上較早研究和利用微生物防治雜草的國家之一， 1963 年山東農(nóng)業(yè)科學院劉志海等（ 1980）研制成功一種對大豆菟絲子有特殊防效的微生物菌劑“魯保一號”?！棒敱Ｒ惶枴笔抢幂私z子盤長孢狀剌盤孢 (又稱膠孢炭疽菌菟絲子?；?)(C )的培養(yǎng)物防除大豆田菟絲子。 60 年代中、后期，在江蘇、山東、安徽、陜西、寧夏等 20 個省區(qū)推廣面積達 60 萬公頃，防治效果穩(wěn)定在 85 以上（高昭遠和干靜娥， 1992）。 目前，世界上很多科研機構在研究微生物除草劑，并且已經(jīng)分離得到許多有活性潛力的生防菌株，如日本自 1987 年以來已從稻田稗草上分離到 10,000 個病原菌（ 992; ，1992; ， 1997; ， 1998; ， 1998; ， 2001）。但由于活體微生物發(fā)病機制復雜，對環(huán)境有較高的依耐性。因此，成功商品化的活體微 生物除草劑卻很少。表 2舉了已商品化的微生物除草劑（付穎和葉非， 2002）。 表 2商品化的活體微生物除草劑 he in 名稱 防除對象 棕櫚疫霉 (致病菌株的厚垣孢子 (莫倫藤 ( 合萌盤長孢狀剌盤孢（ f (弗吉尼亞合萌（ 縱溝柄銹菌 (油莎草（ .） 決明鏈格孢 (決明（ 望江南（ 美麗豬屎豆（ 錦葵盤長孢狀剌盤孢（ f (防除圓葉錦葵（ ）、茼麻（ A. 銀葉菌 (野黑櫻 （ 等木本雜草 鐮刀菌 (絲體 (制劑 ) 列當（ 盤長孢狀剌盤孢（ C 大豆菟絲子 （ 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 文獻綜述 5 黃單孢桿菌（ 高爾夫球場草坪雜草早熟禾（ 劑（ 瓜列當（ 磚紅鐮孢 1200 （ 豆科（ 草 炭疽菌 （ f 卷莖蓼（ .） 縱溝柄銹菌 （ 莎草（ .） 莖點 霉 菌 （ 炭疽病菌（ 田旋花（ .） 單胞銹菌 （ 皺葉酸模（ .）、田薊（ L.) 、矢車菊（ 鏈格孢 （ 茼麻（ A. 鏈格孢 （ ） 南芥（ .） 長孢狀剌盤孢（ f 錦葵（ M. .） 銹菌（ 燈心草粉苞苣 (微生物天然產(chǎn)物防治雜草的潛力和研究進展 近年來，以微生物天然產(chǎn)物開發(fā)生物源除草劑或新穎除草劑的先導化合物引起了雜草科學家和農(nóng)藥化學家的極大興趣。利用微生物天然產(chǎn)物防治雜草具有許多潛在的優(yōu)勢：（ 1）雜草對現(xiàn)有除草劑抗性的發(fā)展需要發(fā)現(xiàn)作用方式新穎的除草劑。許多微生物天然產(chǎn)物具有不同于合成農(nóng)藥的化學特性，研究這些天然產(chǎn)物可能發(fā)現(xiàn)新的除草活性化合物，而其作用位點是現(xiàn)有除草劑未涉及到的； (2)這些微生物天然產(chǎn)物可作為先導化合物； (3)在低濃度時微生物天然產(chǎn)物比化學合成衍生而得 的化合物具有生物活性的可能性大； (4)已登記的化學除草劑，含有氯代烴類化合物的約占 60 ，大多數(shù)微生物天然產(chǎn)物幾乎不含這些化合物，在環(huán)境中的半衰期比合成農(nóng)藥短得多，容易迅速降解或解毒，因此其為登記的試驗比化學農(nóng)藥所用的時間短、資金少； (5)發(fā)酵技術、分子遺傳學和基因工程最新發(fā)展，使大規(guī)模生產(chǎn)微生物天然產(chǎn)物防除雜草成為現(xiàn)實。 許多微生物 (植物病原菌 )在其專一性寄主植物上產(chǎn)生植物