免疫學實驗ppt課件

免疫學實驗 1 免疫學實驗課件 免疫學實驗室 免疫學實驗 2 中性粒細胞的吞噬作用 實驗目的 1 熟悉中性粒細胞吞噬實驗的原理和方法 2 通過本實驗理解機體的非特異性免疫機制 免疫學實驗 3 實驗原理 中性粒細胞具有吞噬殺菌功能 當與顆粒性物質 如葡萄球菌等 混合孵育一定時間后 顆粒性物質被吞噬殺滅 根據吞噬率 吞噬指數可反映該細胞的吞噬功能 免疫學實驗 4 實驗材料 1 表皮 白色 葡萄球菌菌液 濃度6 10億 ml 2 肝素溶液 25U ml 甲醇 堿性美藍 或瑞氏 染液 3 血紅蛋白吸管 凹玻片 載玻片 采血針 微量加樣器 濕盒 顯微鏡 恒溫培養(yǎng)箱 75 酒精 棉簽 香柏油 二甲苯等 免疫學實驗 5 實驗方法 1 用微量加樣器 吸取肝素20ul加入潔凈凹玻片凹孔內 2 用酒精棉簽消毒手指后 刺破皮膚 以血紅蛋白吸管取血40ul 立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔內 并充分混勻 3 用微量加樣器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔內 充分混勻 4 將凹玻片置于濕盒內 30 溫箱中30min 其間每隔10min搖勻一次 5 取一小滴上述混合液 置于載玻片上 用另一載玻片推成薄血片 待干 6 滴加甲醇固定3min 水洗 7 加堿性美藍染色1 2min 水洗 印干 8 置油鏡下觀察吞噬和未吞噬的白細胞并計數 免疫學實驗 6 實驗結果 免疫學實驗 7 實驗思考 1 在吞噬細胞中發(fā)現細菌時 如何區(qū)別吞噬的細菌和粘附在吞噬細胞表面的細菌 2 簡述機體非特異性免疫的概念及特點 免疫學實驗 8 凝集反應 實驗目的 1 了解凝集反應的原理 基本類型及其臨床意義 2 掌握玻片凝集實驗 間接凝集實驗的實驗方法和結果分析 免疫學實驗 9 概述 在一定濃度的電解質溶液中 顆粒性抗原與相應抗體結合后 出現肉眼可見的凝集塊 稱為凝集反應 凝集反應是一種定性的檢測方法 也可以進行半定量檢測 凝集反應可分為直接凝集反應和間接凝集反應 由于凝集反應方法簡便 目前在臨床檢驗中仍被廣泛應用 免疫學實驗 10 一 直接凝集反應細菌 細胞等顆粒性抗原 在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集 稱為直接凝集反應 常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種 玻片凝集試驗 ABO血型鑒定玻片凝集試驗為定性試驗 一般用已知抗體作為診斷血清 與受檢顆粒抗原 如菌液或紅細胞抗原各加一滴在玻片上 混勻 數分鐘后即可用肉眼觀察凝集結果 出現凝集顆粒的為陽性 此法簡便 快速 適用于從病人標本中分離得到的菌種的診斷或分型 也可用于紅細胞ABO血型的鑒定 免疫學實驗 11 實驗原理 人類ABO血型抗原主要有A和B兩種 根據紅細胞表面這兩種抗原的有無可把血型分為四種 據此 將抗A和抗B抗體分別與待測紅細胞混合 抗A或 和 抗B抗體與紅細胞表面上的相應抗原結合而引起紅細胞凝集 據其凝集情況便可判定出受試者的血型 ABO血型的劃分 免疫學實驗 12 實驗材料 1 ABO血型鑒定試劑盒內含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支 2 一次性采血針1枚 潔凈玻片2塊 75 酒精 滅菌棉簽 3 84消毒液 免疫學實驗 13 3 用酒精棉簽消毒被檢者手指尖端 以采血針刺破皮膚 稍加擠壓 使血液流出 用另一載玻片一端取適量血液加入抗抗A分型試劑 并混勻 用另一端再取適量血液加入抗抗B分型試劑 并混勻 用干棉簽止血 4 觀察紅細胞有無凝集發(fā)生 如有凝集 可見紅細胞凝集成塊 無凝集 紅細胞呈均勻分散 判定結果后把玻片放入消毒液中 實驗方法 1 取潔凈載玻片1塊 并標記 如圖 2 將抗A B分型試劑分別加1滴于標記有A B的玻片兩側 抗A 抗B 免疫學實驗 14 實驗結果 記錄受檢者紅細胞凝集情況 根據ABO血型鑒定表 下表 判斷受檢者的血型 ABO血型鑒定表 免疫學實驗 15 二 間接凝集反應將可溶性抗原或抗體先吸附于適當大小的顆粒性載體表面 這種載體與免疫無關 然后與相應抗體或抗原結合 在適量的電解質存在下 出現特異性凝集現象 稱為間接凝集反應 根據載體的不同可將間接凝集反應分為 間接血細胞凝集試驗 間接乳膠凝集試驗 及間接乳膠凝集抑制試驗 和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗等 免疫學實驗 16 間接凝集抑制試驗 妊娠試驗 實驗原理 可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應抗體作用可使乳膠顆粒凝集 此為間接乳膠凝集試驗 若使抗體先與可溶性抗原作用 再加入該抗原致敏的乳膠顆粒 則乳膠凝集被抑制 此為間接乳膠凝集抑制試驗 孕婦尿中絨毛膜促性腺激素 HCG 含量明顯增高 HCG與抗HCG抗體先作用后 再加入HCG致敏的乳膠顆粒 不出現凝集反應 此為妊娠試驗陽性 非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體 抗體與后加入的HCG致敏乳膠結合呈現凝集現象 則妊娠試驗陰性 免疫學實驗 17 實驗材料 1 妊娠診斷試劑盒 內含抗血清 抗HCG 乳膠抗原 HCG致敏 各一支2 待檢尿 孕婦尿 正常尿 3 有格玻片和毛細吸管等 免疫學實驗 18 實驗方法 1 在玻片的第1 第2和第3格內分別加1滴正常尿 待檢尿及孕婦尿 2 每格內加入妊娠診斷試劑抗血清1滴 輕輕搖動1 2min使其充分混勻 3 每格加入乳膠抗原1滴 輕輕搖動玻片3 5min后觀察結果 記錄各標本有無凝集現象 免疫學實驗 19 實驗結果 孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液 無凝集 妊娠試驗陽性 正常尿格出現白色細小凝集物 隨時間延長凝集物變成小塊狀 妊娠試驗陰性 待檢尿若為乳狀液 妊娠試驗陽性 若出現凝集 則妊娠試驗陰性 免疫學實驗 20 注意事項 1 試驗所用診斷試劑用前應充分搖勻 而且應在有效期內使用 2 加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用 3 加樣不宜太多 玻片應始終保持水平 以防兩格之反應液相混 免疫學實驗 21 實驗思考 1 記錄血型鑒定試驗 乳膠妊娠診斷試驗的材料 方法及結果判定 可用圖示或表格方式表示 2 直接凝集試驗與間接凝集試驗有何不同 3 在各凝集試驗中都設有相應對照 有何意義 若對照出現異常如何分析及解決 免疫學實驗 22 沉淀反應 實驗目的 1 掌握對流免疫電泳的基本原理 方法 2 熟悉瓊脂單向擴散 雙向擴散的基本原理 方法 結果分析及臨床用途 3 了解火箭免疫電泳的基本原理 方法 免疫學實驗 23 概述 可溶性抗原如血清 毒素 細菌浸出液等與相應抗體結合 當兩者比例合適 并有適量電解質存在時 形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線 稱為沉淀反應 沉淀反應是臨床上最常用 最基本的方法之一 它的種類較多 可分為瓊脂擴散試驗 免疫電泳試驗 環(huán)狀沉淀試驗及絮狀沉淀試驗等 免疫學實驗 24 一 瓊脂擴散試驗利用可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂內進行擴散 當兩者比例合適時 就出現白色沉淀線 為陽性反應 本試驗可在試管內 平皿中以及玻片上的瓊脂內進行操作 瓊脂擴散試驗可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗 一 單向瓊脂擴散試驗 示教 二 雙向瓊脂擴散實驗 示教 免疫學實驗 25 二 對流免疫電泳 實驗原理 帶電的膠體顆?？稍陔妶鲋幸苿?移動方向與膠體顆粒所帶電荷有關 多數蛋白質抗原在堿性緩沖液中帶負電荷 在電泳時從負極向正極移動 抗體屬球蛋白 在堿性緩沖液只帶微弱的負電荷 而且相對分子質量較大 電泳力較小 在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負極移動 這樣就使抗原和抗體定向對流 在兩孔間相遇時發(fā)生反應 并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線 這種將雙向瓊脂擴散和電泳技術結合在一起的方法稱為對流免疫電泳 免疫學實驗 26 實驗材料 1 電泳緩沖液 pH8 6巴比妥 鹽酸緩沖液 2 抗體 抗AFP 3 抗原 AFP陽性血清 待檢病人血清 4 1 瓊脂用pH8 6巴比妥 鹽酸緩沖液配制 冰箱保存?zhèn)溆?5 電泳儀 電泳槽 載玻片 打孔器 10ml吸管 移液器 移液頭 免疫學實驗 27 實驗方法 1 制板2 打孔3 加樣將抗原加入瓊脂板上有標記孔側的小孔中 抗體加入另一側小孔中 以加滿為度 不可溢出孔外 如圖示 4 電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上 抗原側置陰極端 抗體孔側置陽極端 搭好橋后 接通電源 控制電壓6 10V cm板長 電泳約30 60min 5 關閉電源 取出瓊脂板 觀察結果 免疫學實驗 28 實驗結果 將玻片對著強光源 先觀察AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線 然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現 如有沉淀線 則表示AFP試驗陽性 否則AFP試驗為陰性 免疫學實驗 29 注意事項 1 電泳時電流不宜過大 以免蛋白變性 2 抗原和抗體的電極方向不能搞錯 3 抗原和抗體的濃度要適當 抗原太濃或太稀都不易出現沉淀線 4 電泳所需時間與孔間距離有關 距離越大 電泳時間越長 免疫學實驗 30 實驗思考 1 單向擴散與火箭電泳 雙向擴散與對流免疫電流比較各有何特點 2 對流免疫電泳中 抗原為何放陰極端 抗體為何放陽極端 免疫學實驗 31 外周血單個核細胞的分離 實驗目的 1 熟悉免疫細胞分離的常用方法 2 掌握外周血單個核細胞分離方法的原理 操作規(guī)程 免疫學實驗 32 實驗原理 人外周血單個核細胞 peripheralbloodmononuclearcell PBMC 包括淋巴細胞和單核細胞 單個核細胞的體積 形態(tài)和比重與外周血其他細胞不同 因此利用一種介于1 075 1 090之間而近于等滲的聚蔗糖 泛影葡胺 ficoll hypaque 混合分離液作密度梯度離心 離心后不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布 從而分離出PBMC 免疫學實驗 33 實驗材料 1 肝素溶液用生理鹽水將肝素配成125 250U ml的溶液 置4 下保存?zhèn)溆?2 淋巴細胞分層液市售或自配 20 時密度應為 1 077 0 001 g L 3 Hanks平衡鹽溶液 HBSS 或磷酸鹽緩沖液 PBS pH7 2 7 4 4 完全RPMI 1640培養(yǎng)液 5 15ml或50ml錐底離心管 6 水平離心機 顯微鏡 7 玻璃吸管 滴管 細胞計數板等 8 2 臺盼藍染液 免疫學實驗 34 實驗方法 1 采集靜脈血若干毫升 隨需要而定 注入盛有肝素的無菌小瓶中 每ml全血加0 1ml肝素溶液 加蓋后立即輕輕搖勻 使血液抗凝 2 用吸管加入等體積的室溫HBSS或PBS 使血液等倍稀釋 此步驟亦可省去 3 吸取淋巴細胞分層液 每10ml稀釋血加5m1分層液 置于15m1或50m1離心管中 然后將離心管傾斜45 角 將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面 應注意保持兩界面清晰 勿使血液混入分層液內 免疫學實驗 35 4 將離心管置水平式離心機內 在18 20 下 以2000r min離心30min 離心后 管內分層如下圖所示 免疫學實驗 36 5 用毛細吸管輕輕插入灰白色層 沿管壁輕輕吸出該層的單個核細胞 盛入另一支離心管中 6 將所得到的PBMC懸液用5倍體積的HBSS或RPMI l640洗滌2次 依次以2000r min 1500r min在室溫 18 25 下離心10min 棄上清 7 用完全RPMI 1640定容細胞 計數細胞后再調整細胞至所需濃度 8 用臺盼藍染液檢查所分離細胞的活性 取2滴細胞懸液加1滴2 臺盼藍染液 5 10min后取樣作濕片高倍鏡檢 免疫學實驗 37 實驗結果 臺盼藍染液檢查活細胞不著色 死細胞染成藍色 計數200個細胞 計算活細胞百分率 一般活性應在95 以上 免疫學實驗 38 注意事項 1 與血液樣品接觸時應注意安全防護 避免血源性傳染病傳染 2 操作應輕柔 細胞懸液應充分混勻 避免損傷細胞活性及細胞丟失 3 細胞分層液在室溫下應為 l 077 0 001 g L 應避光4 下保存 取出后逐漸升至室溫后混勻 方可使用 使用中應避免細菌污染 4 稀釋血液可降低紅細胞的凝集 提高淋巴細胞收獲量 但如果要保留血漿成分作其他實驗用時 則不能稀釋血液 以免影響血漿成分 免疫學實驗 39 免疫系統(tǒng)組分的分離及活性檢測 實驗目的 1 掌握免疫系統(tǒng)組分中胸腺 脾組織結構及淋巴細胞的功能 2 熟悉淋巴細胞分離方法 3 建立對免疫學的整體概念 加深對免疫系統(tǒng)組成和功能及重要性的理解 提高學習興趣及主動性 4 培養(yǎng)學生在實際工作中動手 動腦 觀察和分析與解決問題的能力 免疫學實驗 40 一 小鼠胸腺 脾摘除術 實驗原理 小鼠的胸腺和脾是研究T細胞和B細胞特性與功能最主要的材料來源 觀察其組織結構 細胞數目及活性等 可進一步了解該機體的免疫狀況 是目前探討免疫學理論及與其有關疾病的最好模型之一 故摘除胸腺和脾是進行研究的前提 免疫學實驗 41 實驗材料 1 昆明種小鼠20 24g 2 75 酒精 無菌棉簽 3 小手術臺 大頭針 眼科鑷子 剪子 免疫學實驗 42 實驗方法 1 取小鼠一只以眼球采血 抗凝備用 處死 2 小鼠用大頭針固定在小手術臺上 位置擺正 3 用75 的酒精消毒小鼠皮膚 4 打開腹腔及分離胸骨后軟組織 5 用眼科剪從腹部向上沿正中線剪開胸骨到頸部 6 暴露胸腺后輕輕剝離兩葉胸腺 7 在上腹部剝離脾 剪除結締組織被膜 免疫學實驗 43 實驗結果 觀察胸腺 脾組織結構及其是否完整 有時間可在電子天秤稱重 注意事項 1 剝離胸腺時要特別小心 以保證兩葉完整性 2 剝離胸腺 脾時要完全去掉其他組織 免疫學實驗 44 二 小鼠淋巴細胞分離及活性檢測實驗原理 材料 方法及結果略 與前述外周血單個核細胞分離基本相同 不同之處 1 小鼠淋巴細胞的密度為1 098g ml 故分層液的密度不同 2 取胸腺 脾經200目鋼絲網過篩的細胞懸液 用分離層液分離淋巴細胞 3 取眼球血液用分層分離淋巴細胞 免疫學實驗 45 實驗思考 1 為什么取胸腺和脾制備淋巴細胞 可了解機體的免疫功能 2 如何理解機體免疫系統(tǒng)各組成部分功能正常的重要性 3 分離淋巴細胞的意義何在 4 為進一步了解機體免疫功能還需進行哪些檢測 免疫學實驗 46 免疫酶技術 免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性與酶的高效催化作用有機結合的一種方法 它以酶作為標記物 與抗體 或抗原 聯結 與相應的抗原 或抗體 作用后 通過底物的顏色反應作抗原抗體的定性和定量 亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究 即酶免疫組織化學技術 目前應用最多的免疫酶技術是酶聯免疫吸附實驗 ELISA 它是將可溶性抗原 或抗體 吸附于固相載體上 加入酶標抗體 或抗原 與吸附在載體上的抗原 或抗體 結合 形成酶標記復合物 再加入酶底物時 即可顯色 顏色反應的深淺與相應的抗體或抗原量相關 常用的酶有辣根過氧化物酶 HRP 和堿性磷酸酶 AP 相應的底物分別是鄰苯二胺 OPD 和對硝基苯磷酸鹽 實驗方法有間接法 夾心法和競爭法 免疫學實驗 47 一 ELISA夾心法檢測HBsAg 實驗目的 1 熟悉ELISA的原理 夾心法 2 了解免疫標記技術的原理 實驗原理 采用多克隆抗 HBS包被反應板 加入待測標本 同時加入單克隆抗 HBs HRP 如待測標本中含有HBsAg時就與包被抗 HBs 抗 HBs HRP結合形成復合物 加入TMB底物產生顯色反應 反之就無顯色反應 免疫學實驗 48 實驗材料 1 乙肝病毒HBsAg酶聯免疫診斷試劑盒 由廠商供應 預包被微孔條 用純化的抗 HBs包被 酶聯試劑 用HRP標記的抗HBs HBsAg陽性對照 HBsAg陰性對照 洗滌液 濃縮液 顯色劑A B 終止液 2mol LH2SO4 2 微量加樣器 混合振蕩器 酶標測定儀 恒溫箱 吸水紙 蒸餾水等 免疫學實驗 49 實驗方法 1 配液濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋使用 2 編號將微孔條固定于支架 按序編號 3 加樣分別用加樣器加待檢血清和陰 陽性對照50 1 1滴 于相應孔中 設空白對照孔 加50 1洗滌液 4 加酶除空白對照外 每孔加酶聯試劑50 l 1滴 5 溫育振蕩混勻 置37 30min后取出 6 洗滌甩去孔內液體 扣干 用洗滌液注滿各孔 靜置2s 甩干 重復5次后拍干 7 顯色每孔加顯色劑A B各50 l 1滴 振蕩混勻 37 暗置15min 免疫學實驗 50 實驗結果 1 目測在白色背景下觀察各孔顯色情況 有明顯藍色者為陽性 無色者為陰性 2 酶標儀檢測每孔加終止液50 l 1滴 混勻 用酶標儀450nm波長測各孔A值 計算P N值 結果判斷 P N值 2 1者為陽性 2 1者判為陰性 陰性對照孔A值小于0 05時以0 05計 免疫學實驗 51 注意事項 1 試劑盒應于4 存放 在有效期內使用 2 微孔條須密封防潮 從冷藏環(huán)境中取出時 應在室溫中平衡至潮氣盡干后方可開封啟用 余者及時封存 3 滴加試劑前應將瓶搖勻 使液體混勻 滴加時瓶身應保持垂直 以使滴量準確 注意勿將試劑滴在孔壁上 4 洗滌時各孔均須加滿 防止孔口內有游離酶未能洗凈 5 待測標本不可用NaN3防腐 所有樣品都應按傳染源處理 免疫學實驗 52 ELISA競爭法檢測抗 HBc 實驗目的 1 熟悉ELISA的原理 方法 2 了解免疫標記技術的原理 實驗原理 采用基因工程重組HBcAg