光引發(fā)聚合改性明膠用于牙組織工程的方法觀察論文.doc

光引發(fā)聚合改性明膠用于牙組織工程的方法觀察論文 組織工程化牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體常用的支架材料有羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）-磷酸三鈣（tricalciumphosphate，TcP）、納米碳化硅（siliconcarbide，sic）增強(qiáng)HA復(fù)合材料，明膠、膠原、甲殼素等，三維支架為新生組織提供了生長空間，支持細(xì)胞生長，增殖并模擬胞外基質(zhì)的許多功能。明膠被廣泛用作生物醫(yī)用材料，但其凝膠性不耐久，35以上即溶化為溶膠態(tài)。如果利用明膠側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)活性高的性質(zhì)，將丙烯酸類單體接枝到明膠分子上，就可在正常體溫條件下長時(shí)間保持明膠的凝膠形態(tài)。甲基丙烯酸（methylacrylicacid，MA）改性后的明膠在紫外光和光引發(fā)劑共同作用下可生成水凝膠，是軟骨組織工程研究中使用的一種支架材料，這種可注射光引發(fā)聚合水凝膠材料能夠自我塑形，用于填充形狀和尺寸各異的組織缺損，造成的創(chuàng)傷小，能使得細(xì)胞均勻分布在支架材料內(nèi)部呈三維立體生長，提供仿生的環(huán)境，水凝膠含有大量的水分可支持營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的交換。因此本研究以人牙髓細(xì)胞（humandentalpulpcell，hDPC）為對(duì)象，研究光引發(fā)聚合甲基丙烯酸改性明膠（gelatinmethacrylate，GM）水凝膠是否有作為牙髓再生支架材料的潛能。 1.材料和方法 1.1材料 A型明膠（acid-processedgelatin，G）、94%MA、艷固佳2959型光引發(fā)劑（Sigma公司，美國），透析袋（Biosharp公司，美國），a型改良伊格爾培養(yǎng)基（modi-fiedeaglesmediumofalphatype，u-MEM）、改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（dulbeosmodifiedeaglemedium，DMEM）（Hyclon公司，美國），胎牛血清（fatalbovineserum，F(xiàn)BS）（Hyclon公司，美國）；磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）（武漢博士德生物工程有限公司），青霉素-鏈霉素、I型膠原酶、分散酶、0.25%胰酶（Gibco公司，美國）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cellcountingkit，CCK）-8（Kumamoto公司，日本）；臺(tái)盼藍(lán)染液（Sigma公司，美國）；平底六孔培養(yǎng)板（Nunc公司，美國）。紫外光交聯(lián)儀（Hoefer公司，美國）；冷凍干燥機(jī)（北京博儀康公司）；ACE200型200MHz高分辨率超導(dǎo)核磁共振（nuclearmagicresonance，NMR）儀（Bruker公司；德國）；掃描電子顯微鏡（scan-ningelectronmicroscope，SEM）（FEI公司，荷蘭）；旋轉(zhuǎn)流變儀（Haake公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；倒置熒光顯微鏡及照相系（Olympus公司，日本）。 1.2方法 1.2.1合成GM將1gG與10mLPBS溶液混合，在50恒溫條件下攪拌20min以上直至明膠完全溶解，再緩緩加入濃度為94%的MA1mL，繼續(xù)在50條件下攪拌，反應(yīng)持續(xù)1h。隨后加入10的PBS溶液40mL，充分混合后置于截留相對(duì)分子量為（8-14）103的透析袋中，在40條件下用雙蒸水透析1周。透析后的溶液用液氮迅速冷凍后，真空冷凍干燥機(jī)凍干處理1周，密封保存于-80。 1.2.2分析GM1）NMR：取0.5mgGM、G和MA分別溶于D.0，用高分辨率超導(dǎo)NMR檢測(cè)三者的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，并對(duì)比。2）SEM：分別掃描GM的斷面和表面，觀察其表面形貌。 1.2.3制備GM水凝膠用60的PBS將GM配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液，0.02um濾器過濾除菌后，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)內(nèi)操作。取10mL該溶液，加入50mg光引發(fā)劑充分混勻，配成GM水凝膠準(zhǔn)備液。取1mLGM水凝膠準(zhǔn)備液置于六孔板中，放入紫外交聯(lián)儀，選擇光強(qiáng)8mWcm-2、365nm條件下輻照10min，GM準(zhǔn)備液聚合成GMTk凝膠。 1.2.4GM水凝膠的力學(xué)性能質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的GM準(zhǔn)備液制備成的直徑約50nm，厚度大于1mm的GM水凝膠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%G溶液制備成的G凝膠設(shè)為對(duì)照組，規(guī)格同上。選用37恒溫-頻率掃描模式，用流變儀檢測(cè)2組的黏彈性，間接反映2種材料的力學(xué)性能。 1.2.5培養(yǎng)hDPC取臨床18-25歲患者因阻生需要拔除的健康完整的牙齒（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且患者知情同意），參照Gronthos采用的取材方法，在無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓組織，切除根尖1/3部分，PBS反復(fù)沖洗；將牙髓組織剪碎成小于1mmx1mmx1mm的組織塊，含3gL-1的I型膠原酶和4gL-1的分散酶溶液于37水浴鍋中消化組織塊30min，離心5min、棄上清，含20%FBS的u-MEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，混勻后接種于25cm22培養(yǎng)瓶中，37、5%CO2溫箱中培養(yǎng)2d，半量換液，然后每3d更換培養(yǎng)基1次。待細(xì)胞生長融合達(dá)80%時(shí)，0.25gL-1胰酶消化傳代，按1105個(gè)mL-1細(xì)胞數(shù)接種傳代后培養(yǎng)。 1.2.6GM水凝膠的細(xì)胞毒性和生物相容性1）直接法：取第三代hDPC，用無菌的GM水凝膠準(zhǔn)備液制備成細(xì)胞濃度為1106個(gè)，mL-I的細(xì)胞懸液，在紫外光聚合反應(yīng)中形成細(xì)胞GM水凝膠，隨后轉(zhuǎn)移至已添加培養(yǎng)基的六孔板中，常規(guī)培養(yǎng)3d之后，在光鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。2）間接法：以GM水凝膠：DMEM培養(yǎng)基=0.2g：1mL的比例，密封后置于細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中3d，提取GM水凝膠浸提液作為A組；用同樣的方法處理DMEM培養(yǎng)基作為B組。A、B兩組液體分別加入10%FBS，1%雙抗，培養(yǎng)hDPSC。3d后小心棄去孔板中的培養(yǎng)基，PBS清洗后加入數(shù)滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，室溫下染色，5min后吸出染液，PBs清洗殘留染液，光鏡下觀察藍(lán)染細(xì)胞，評(píng)估GM水凝膠的細(xì)胞毒性。CCK-8法測(cè)A組和B組培養(yǎng)7d的細(xì)胞增殖曲線，從而評(píng)估GM水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 2.結(jié)果 2.1GM的制備與表征 MA改性明膠在光引發(fā)劑引發(fā)下，經(jīng)紫外光輻照后形成水凝膠。GM凍干后肉眼可見呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，易溶于水，SEM掃描斷面可見大小均一數(shù)量頗多的孔隙結(jié)構(gòu)（圖1左），孔徑大約10um，而表面的圖像也能看到致密多孔（圖1右），孔徑15-25um，這種結(jié)構(gòu)在形成水凝膠仍然會(huì)保持，孔隙會(huì)增大，有利于細(xì)胞的黏附長入，并且可保留大量水份支持細(xì)胞的營養(yǎng)代謝。從NMR圖像（圖2）上來看，可以看到GM結(jié)合了MA的甲基，在（56）10-6處形成了代表特征性的MA酰胺結(jié)構(gòu)的峰，而改性前后明膠特異性的譜圖基本保持一致，說明改性對(duì)明膠的整體分子結(jié)構(gòu)沒有重大影響。 2.2GM水凝膠的力學(xué)性能 在使用流變儀測(cè)量過程中，GM水凝膠的形態(tài)沒有出現(xiàn)明顯變化，而G凝膠在37恒溫測(cè)量臺(tái)上已經(jīng)變成溶膠狀態(tài)。測(cè)量結(jié)果如圖3所示，在0.01-100Hz的頻率掃描模式下，GM水凝膠儲(chǔ)存模量接近于明膠的10000倍，說明GM水凝膠具有彈性，在一定的范圍內(nèi)，隨著頻率的增加，GM水凝膠的彈性模量和損耗模量幾乎保持不變。而G凝膠則明顯不同，彈性模量與損耗模量則隨著頻率的增加而大幅度增加。說明在經(jīng)過甲基丙烯酸改性之后，減少了明膠分子鏈之間的滑動(dòng)，彈性模量和損耗模量受頻率的影響大大降低（圖3）。 2.3GM水凝膠的細(xì)胞毒性和生物相容性 用CCK-8測(cè)量7d的增殖曲線（圖4），可見GM浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度略低于DMEM培養(yǎng)基，但基本保持逐漸遞增的趨勢(shì)，說明GM水凝膠對(duì)hDPC無明顯毒性抑制作用，在一定程度上能維持細(xì)胞的生長。 將牙髓細(xì)胞-GM準(zhǔn)備液懸液經(jīng)紫外光引發(fā)聚合形成細(xì)胞GM水凝膠，培養(yǎng)2d后觀察到細(xì)胞能在凝膠中維持基本形態(tài)。用GM水凝膠浸提液培養(yǎng)細(xì)胞，與普通DMEM培養(yǎng)基對(duì)照，2d后用臺(tái)盼藍(lán)染色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，鏡下可見少有細(xì)胞藍(lán)染，其余細(xì)胞形態(tài)良好（圖5）。 3.討論 牙組織工程是時(shí)下研究熱點(diǎn)之一，組織工程牙髓再生能夠規(guī)避傳統(tǒng)根管治療的弊端，恢復(fù)牙髓的支持營養(yǎng)功能，避免牙髓喪失造成的牙體變脆崩裂。以往研究中用HA-TCP支架材料復(fù)合牙髓細(xì)胞再生牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，在裸鼠皮下得到了很好的效果，但原位再生研究要考慮牙齒根管系統(tǒng)形態(tài)多樣，錯(cuò)綜復(fù)雜，應(yīng)該選用一種可以任意塑形，和天然牙髓組織相近的支架材料，使種子細(xì)胞呈三維生長，從而構(gòu)建再生牙髓。 明膠的分子構(gòu)象為雜亂的多肽鏈，側(cè)鏈上有大量的羥基、羧基和氨基。本研究利用MA與側(cè)鏈上的氨基結(jié)合形成MA酰胺結(jié)構(gòu)，可以使明膠的一些理化性能得到優(yōu)化，比如增加了多孔性，且在紫外光引發(fā)下能聚合成水凝膠。GM形成凝膠態(tài)后，表面依然保留多孔結(jié)構(gòu)，孔徑約為100um，牙髓細(xì)胞接種后能較好地黏附、長入、形成三維生長的模型。采用紫外光引發(fā)聚合形成的GM水凝膠在37條件下性能穩(wěn)定。用流變儀測(cè)量力學(xué)性能，GM水凝膠能在0100Hz的頻率遞增條件下保持高水平的穩(wěn)定，機(jī)械性能大大優(yōu)于普通明膠。說明GM水凝膠可以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中保持穩(wěn)定，抵抗一定的機(jī)械作用力。另一方面，通過浸提液培養(yǎng)法及CCK-8法檢測(cè)，間接證明了本材料具