rhEPO對卵巢癌HO8910細(xì)胞表面TfR表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響.doc

rhEPO對卵巢癌HO8910細(xì)胞表面TfR表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響作者：楊澤敏,馬沐雅,馮玫單位：山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001【摘要】目的：通過卵巢癌HO8910細(xì)胞表面的TfR(CD71)在rhEPO干預(yù)前后的表達(dá)情況來觀察rhEPO對細(xì)胞增殖的影響，探討其在腫瘤相關(guān)性貧血中的治療價值。方法：用RTPCR法檢測經(jīng)不同濃度的rhEPO處理后的和未經(jīng)rhEPO處理的HO8910細(xì)胞表面的TfR mRNA表達(dá)情況：用流式細(xì)胞儀觀察和檢測處理前后的HO8910細(xì)胞周期上的差異。結(jié)果：不同濃度的rhEPO培養(yǎng)HO8910細(xì)胞48 h，72 h后，TfR表達(dá)均減少，與同期對照組相比差異有顯著意義(P0.01)；經(jīng)不同濃度的EPO在不同時間處理后的HO8910及未經(jīng)EPO處理的HO8910在細(xì)胞周期上，與同期對照組相比差異有顯著意義(P0.01)，且較對照組有所減少。結(jié)論：經(jīng)過高濃度的rhEPO處理后，卵巢癌HO8910細(xì)胞表面TfR的表達(dá)減少，S期細(xì)胞百分率也有所降低，間接提示了高濃度的rhEPO可能通過鐵代謝抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞的生長、增殖。 【關(guān)鍵詞】 EPO；TfR：孵巢癌；貧血；細(xì)胞增殖 Effect of rhEPO on the expression of TfR residing on the surface of human cancer cell line HO8910 and the proliferation of cell YANG Zemin1，MA Muya1，F(xiàn)ENG Mei2 (1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.The People′s Hospital of Shanxi Province，Taiyuan 030012，China) Abstract Objective：To detect the expression of TfR residing on the surface of the HO8910 cultured with EPO and cultrured without EPO，accordingly to observe the effect of EPO on the proliferation of human cancer cell line HO8910，and approach the mangagement value of EPO.Methods：To detect the expression of TfR residing on the surface of the HO8910 cultured with EPO and without EPO by RTRCR.To detect the difference of cancer cell cycle by FCM.Results：The expression of TfR of the HO8910 cultured with EPO decreased to that of the HO8910 cultured without EPO，and it had statistical singificance.The percentage of the S cell cycle of the HO8910 cultured with EPO did not decrease to that of the HO8910 cultured without EPO.Conclusion：The high concentration of EPO might repress the HO8910 proliferation. Key words EPO；TfR；ovarian cancer；anaemia proliferation 腫瘤相關(guān)性貧血普遍存在且明顯影響患者的生存質(zhì)量。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，rhEPO的問世及臨床應(yīng)用，為腫瘤相關(guān)性貧血的治療提供了一條新途徑。目前的臨床研究印證了rhEPO作為輸血的替代療法對腫瘤相關(guān)性貧血治療的有效性和安全性，但是近年研究發(fā)現(xiàn)，除了紅細(xì)胞系統(tǒng)外，多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)EPOR1，2，而且報道EPO對白血病細(xì)胞株體外實(shí)驗(yàn)有增值反應(yīng)3。 為了進(jìn)一步探討rhEPO對腫瘤細(xì)胞是否有增殖作用，我們的實(shí)驗(yàn)研究從與細(xì)胞增殖相關(guān)的抗原TfR的表達(dá)情況以及HO8910細(xì)胞周期的差異出發(fā)，探討rhEPO對HO8910細(xì)胞表面TfR表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。 1 資料與方法 1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用人卵巢癌細(xì)胞株HO8910由山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。EPO是由沈陽三生制藥有限責(zé)任公司提供。TfR mRNA在HO8910細(xì)胞表面表達(dá)用RTPGR方法測定。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR擴(kuò)增儀為美國PE公司提供。流式細(xì)胞儀為美國BD公司提供。 1.2 方法 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HO8910細(xì)胞在復(fù)蘇后用RMPI1640培養(yǎng)基加10胎牛血清在37，5CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2 d后備用。 1.2.2 流式細(xì)胞儀(FCM)方法 HO8910細(xì)胞穩(wěn)定傳代2 d后，取6瓶HO8910細(xì)胞，加入含有濃度分別為50，100，200 U/mL的EPO的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)組。同時以2瓶沒有加EPO的HO8910細(xì)胞為對照組。分別在48 h和72 h后，用離心沉淀法收集各培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，按照流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期專用試劑盒的操作說明，送流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的測定。以上步驟重復(fù)3次，取其平均值，不同濃度的EPO不同時間對HO8910細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響見表1。 1.2.3 RTPCR擴(kuò)增 詳細(xì)方法按試劑盒說明書，引物序列如下： 上游引物5GGAGGAGCCAGGAGAGGGACTT3′。下游引物5CTCAGCAAAGTCTGGCGTGAT3′。產(chǎn)物長度為226bp，取2 μL反應(yīng)液，用1.5瓊脂糖凝膠電泳照相分析。結(jié)果見表2。 1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 FCM方法的結(jié)果以細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞比例表示出來，RTPCR擴(kuò)增HO8910細(xì)胞表面的TfR，以TfR mRNA擴(kuò)增帶與β肌動蛋白擴(kuò)增帶的灰度比值為TfRmRNA表達(dá)的相對值，結(jié)果用±s表示，利用統(tǒng)計軟件SPSS11.5for Windows進(jìn)行析因設(shè)計的方差分析，LSDt檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取a0.05。 2 結(jié) 果 2.1 流式細(xì)胞儀(FCM)方法 不同濃度的EPO不同時間對HO8910細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響(見表1)。表1 不同濃度的EPO不同時間對HO8910細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響S期細(xì)胞百分率同一時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比P0.01。2)實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比P0.05。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度的EPO處理組在48，72 h這兩個時間點(diǎn)，與對照組相比時，P0.01，且經(jīng)不同濃度的EPO處理組的S期細(xì)胞百分率較對照組有所減少，但不同濃度處理組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。對于同一濃度的EPO處理組在不同時間點(diǎn)相比，P0.05。 2.2 RTPCR擴(kuò)增 不同濃度的EPO不同時間對HO8910細(xì)胞表面的TfR表達(dá)的影響(見表2)。表2 不同濃度的EPO不同時間對HO8910細(xì)胞表面TfR表達(dá)的影響TfR mRNA表達(dá)的相對值同一時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比P0.01。2)實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比P0.05。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度的EPO處理組在48，72 h這兩個時間點(diǎn)，與對照組相比時，P0.01，且經(jīng)不同濃度的EPO處理組的TfR mRNA表達(dá)的相對值均較對照組有所減少，但不同濃度處理組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。對于同一濃度的EPO處理組在不同時間點(diǎn)相比，P0.05。 3 討 論 腫瘤患者一旦出現(xiàn)貧血，將嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是影響其預(yù)后的一個重要因素。糾正腫瘤相關(guān)性貧血可以顯著改善患者的生存質(zhì)量，因此，提倡將腫瘤相關(guān)性貧血的治療作為腫瘤整體治療的一部分46。過去，改善貧血的傳統(tǒng)辦法是輸血，然而輸血存在著很多潛在危險，如效果差、費(fèi)用高、血源缺乏等，輸血的免疫抑制問題也被Heiss等7的隨機(jī)分組研究證實(shí)。結(jié)果顯示，輸異體血患者的局部腫瘤復(fù)發(fā)的危險性明顯高于輸自體血的患者(P0.001)，而EPO能減少這些危險。 在婦科惡性腫瘤治療中，EPO的應(yīng)用越來越受到重視。EPO/rHuEPO用于合并貧血的婦科惡性腫瘤患者可以為這類患者完成化療提供保障。Kurz等8將35 例聯(lián)合化療同時皮下注射rHuEPO 150 U/kg，每周3次，連用12周，如在用藥的第4、8、12周測定血紅蛋白水平，增加20 g/L或Hb120 g/L認(rèn)為有效，需輸血(Hb80 g/L，RBC3×1012/L，臨床表現(xiàn)為貧血)則為無效。結(jié)果顯示，治療組有效率為56.6，僅有5 例患者需輸血，而對照組66.6的患者需輸血，而且治療組rHuEPO有效患者體力較用藥前明顯增加。 近年來隨著對EPOR與EPO的深入研究，發(fā)現(xiàn)EPO的作用不僅僅限于紅系細(xì)胞。國內(nèi)學(xué)者周密等9的近期研究發(fā)現(xiàn)：不同濃度的rhEPO處理白血病細(xì)胞(K562細(xì)胞)72 h均能顯著增加CD71抗原的表達(dá)，另外研究還發(fā)現(xiàn)用rhEPO處理K562細(xì)胞后可使S期細(xì)胞百分率上升，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。 Mittelman等10研究表明在大鼠骨髓瘤模型中大劑量應(yīng)用不但不會促進(jìn)腫瘤生長，反而誘導(dǎo)腫瘤緩解，延長存活期，降低死亡率?？赡苁窃龈叩哪艽龠M(jìn)腫瘤內(nèi)部氧化，從而改善低氧對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、治療耐藥的有害影響11。 那么針對rHuEPO對腫瘤細(xì)胞的增殖作用是否產(chǎn)生一定影響，在本實(shí)驗(yàn)中決定從與細(xì)胞增殖相關(guān)的抗原TfR的表達(dá)水平及細(xì)胞周期出發(fā)，以卵巢癌細(xì)胞株為對象，對EPO在臨床的實(shí)用價值進(jìn)行進(jìn)一步的研究。研究結(jié)果提示HO8910細(xì)胞表面有FfR mRNA的表達(dá)，這是該種細(xì)胞表面有TfR存在的間接證據(jù)。其次本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的EPO濃度梯度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于臨床用藥的濃度范圍，實(shí)驗(yàn)濃度比臨床用藥濃度高1萬倍以上，如表2的結(jié)果顯示：在48，72 h這兩個時間點(diǎn)，與對照組相比，經(jīng)不同濃度的EPO處理組的TfR mRNA表達(dá)的相對值均較對照組有所減少，但不同濃度處理組之間沒有差異。因此這一結(jié)果說明EPO并沒有促進(jìn)HO8910細(xì)胞增殖的作用，而且提示了高濃度的rhEPO抑制HO8910細(xì)胞表面TfR的表達(dá)。其次表1的結(jié)果顯示經(jīng)過高濃度的rhEPO處理后，HO8910細(xì)胞較對照組進(jìn)入S期的細(xì)胞百分率減少，不同濃度處理組之間沒有差異，這與實(shí)驗(yàn)中TfRmRNA表達(dá)情況是相符合的。由于腫瘤細(xì)胞對鐵的需求高，因此對鐵的攝取率高，鐵代謝活躍，TfR的表達(dá)相應(yīng)增加，那么細(xì)胞內(nèi)參與DNA合成的鐵增多，使進(jìn)入S期的細(xì)胞相應(yīng)增多，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。但在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過高濃度的rhEPO處理后，HO8910細(xì)胞表面TfR的表達(dá)減少，鐵的攝取率降低，進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，這種鐵剝奪狀態(tài)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，是不利于腫瘤細(xì)胞的增殖的。 因此本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果表明：rhEPO可能通過參與HO8910細(xì)胞的鐵代謝過程，直接或間接地抑制細(xì)胞的生長、增殖。因此，對于臨床應(yīng)用rhEPO治療腫瘤相關(guān)性貧血時，我們不僅沒有找到rhEPO對腫瘤細(xì)胞有增殖作用的直接證據(jù)，反而從實(shí)驗(yàn)研究的角度出發(fā)更加進(jìn)一步肯定了其在腫瘤相關(guān)性貧血中的治療價值。但rhEPO參與和調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵代謝過程的機(jī)制值得進(jìn)一步深入探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Kanoori S，Akihiro T.Expression of erythropoietin receptors on acute leukemia cells and their response to erythropoietin in vitroJ.Jpn J Cancer Res，1996，87(9)：422423.12 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