基因工程的基本操作程序

1 2基因工程的基本操作程序 2020 4 18 1 基因工程基本操作的四個步驟 1 目的基因的獲取 2 基因表達載體的構(gòu)建 3 將目的基因?qū)胧荏w細胞 4 目的基因的檢測與鑒定 前提 核心 關(guān)鍵 保證 一 目的基因的獲取 一 目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的基因 請舉出三個以上的例子 二 獲取目的基因的常用方法有哪些 1 從基因文庫中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴增 3 人工合成 請閱讀P9第一和二兩段 也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 一 目的基因的獲取 一 從基因文庫中獲取目的基因 1 基因文庫 概念見P9 2 基因文庫的分類 種類 基因組DNA文庫 含有一種生物的全部基因 部分基因文庫 只包含了一種生物的部分基因 如 cDNA文庫 先建立基因文庫 再從中篩選 提取某種生物的全部DNA 用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段 將DNA片段與載體連接 導(dǎo)入受體菌中儲存 基因組文庫 3 構(gòu)建基因文庫 1 構(gòu)建基因組文庫 某種生物的單鏈mRNA 單鏈互補DNA 雙鏈cDNA片段 導(dǎo)入受體菌中儲存 與載體連接 cDNA文庫 反 逆 轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 2 構(gòu)建cDNA文庫 3 構(gòu)建基因文庫 基因組文庫和部分基因組文庫 cDNA文庫 比較 注意 基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因 而是保存受體菌 菌中含基因 4 從基因文庫直接獲取目的基因 怎樣從基因文庫中獲取目的基因呢 1 獲取目的基因的根據(jù) 如 根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性 4 從基因文庫直接獲取目的基因 2 用DNA探針從基因文庫中獲取目的基因 不需要模板 但需要知道序列 來構(gòu)建探針 4 從基因文庫直接獲取目的基因 2 用DNA探針從基因文庫中獲取目的基因 不需要模板 但需要知道序列 來構(gòu)建探針 也可以用PCR方式從基因文庫中獲取目的基因 為什么要構(gòu)建基因文庫 直接從含目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎 構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一 并不是唯一的方式 如果所需要的目的基因序列已知 就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中 直接獲得 也可以通過反轉(zhuǎn)錄 用PCR方式從mRNA中獲得 不一定要構(gòu)建基因文庫 但如果所需要的目的基因的序列完全不知 或只知道目的基因序列的一段 或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因 或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同 或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同 或者想得到一種生物的全基因組序列 往往就需要構(gòu)建基因文庫 二 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 二 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 前提 有一段已知目的基因的核苷酸序列 以便合成引物 原理 利用DNA雙鏈復(fù)制原理 過程 變性 退火 延伸三步曲 變性 加熱至90 95 雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火 冷卻至55 60 部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸 加熱至70 75 在Taq酶作用下 合成互補的新DNA鏈 注意 雙鏈DNA中 G和C比例越高 DNA變性溫度越高 二 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 概念 PCR全稱為 是一項在生物 復(fù)制 的核酸合成技術(shù) 條件 原理 方式 以 方式擴增 即 n為擴增循環(huán)的次數(shù) 結(jié)果 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定DNA片段 DNA復(fù)制 有一段已知基因的核苷酸序列 四種脫氧核苷酸 一對引物 耐熱的DNA聚合酶 Taq酶 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增 二 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 過程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 60 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 從引物處延伸 合成與模板互補的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 2020 4 18 20 33 8分 請回答基因工程方面的有關(guān)問題 1 利用PCR技術(shù)擴增目的基本因 其原理與細胞內(nèi)DNA復(fù)制類似 如下圖所示 圖中引物中為單鏈DNA片段 它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ) 漢水丑生的生物同行 超級群大型公益活動 歷年高考題PPT版制作 本課件為公益作品 版權(quán)所有 不得以任何形式用于商業(yè)目的 2012年1月15日 漢水丑生標(biāo)記 從理論上推測 第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占比例為 在第輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段 15 16 三 漢水丑生的生物同行 超級群大型公益活動 歷年高考題PPT版制作 本課件為公益作品 版權(quán)所有 不得以任何形式用于商業(yè)目的 2012年1月15日 漢水丑生標(biāo)記 模板DNA PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點 第1輪結(jié)束 第2輪開始 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點 第2輪結(jié)束 2 設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一 某同學(xué)設(shè)計的兩組引物 只標(biāo)注了部分堿基序列 都不合理 如下圖 請分別說明理由 第一組 引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補配對而失效 引物I 自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效 漢水丑生的生物同行 超級群大型公益活動 歷年高考題PPT版制作 本課件為公益作品 版權(quán)所有 不得以任何形式用于商業(yè)目的 2012年1月15日 漢水丑生標(biāo)記 漢水丑生的生物同行 超級群大型公益活動 歷年高考題PPT版制作 本課件為公益作品 版權(quán)所有 不得以任何形式用于商業(yè)目的 2012年1月15日 漢水丑生標(biāo)記 目的基因的mRNA 單鏈DNA cDNA 雙鏈DNA 即目的基因 反轉(zhuǎn)錄 合成 1 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 目的基因 推測 推測 化學(xué)合成 2 人工化學(xué)合成法 三 人工合成目的基因 在DNA合成儀中合成 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA 基因比較小 核苷酸序列已知 二 基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心 目的 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用 原核細胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 終止子 編碼區(qū) 能轉(zhuǎn)錄 編碼蛋白質(zhì) 非編碼區(qū) 不編碼蛋白質(zhì) 能調(diào)控遺傳信息表達 2020 4 18 33 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 啟動子 終止子 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 內(nèi)含子 外顯子 與RNA聚合酶結(jié)合位點 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 外顯子 內(nèi)含子 能編碼蛋白質(zhì)的序列 不能編碼蛋白質(zhì)的序列 2020 4 18 34 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) RNA聚合酶結(jié)合位點 外顯子 內(nèi)含子 終止子 啟動子 原核 真核 基因的結(jié)構(gòu) 2020 4 18 35 原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較 思考 編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì) 原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎 連續(xù) 不連續(xù) 編碼區(qū) 非編碼 2020 4 18 36 2 表達載體的組成啟動子終止子目的基因標(biāo)記基因等 質(zhì)粒 DNA分子 限制酶處理 一個切口兩個黏性末端 兩個切口獲得目的基因 DNA連接酶 重組DNA分子 重組質(zhì)粒 同一種 3 過程 載體與表達載體的區(qū)別 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段 表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子 終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞 必需以表達載體的方式攜帶進去 注意 1 構(gòu)建重組質(zhì)粒時 需用切割含目的基因的DNA和載體 目的是 切割含目的基因的DNA和載體并非只能用同一種限制酶 2 為防止載體與目的基因自身環(huán)化 應(yīng)該怎么做 3 目的基因與載體成功連接的基礎(chǔ)是什么 4 目的基因的插入位點不是隨機的 目的基因的插入不能破壞載體上自身需要的基因片段 以及其上的標(biāo)記基因 且插入在啟動子和終止子之間 5 受體細胞不同 基因表達載體的構(gòu)建也會有差異 基因工程載體的構(gòu)建需要考慮的因素 1 基因的特點 若來自動物的目的基因含有內(nèi)含子 不能用于轉(zhuǎn)基因植物 若基因產(chǎn)物是糖蛋白 該基因在原核生物中的表達蛋白不具備天然的活性 2 要選擇強啟動子或組織特異性啟動子 3 要有選擇標(biāo)記基因 三 將目的基因?qū)胧荏w細胞 一 轉(zhuǎn)化 二 方法 將目的基因?qū)胫参锛毎?將目的基因?qū)雱游锛毎?將目的基因?qū)胛⑸锛毎?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 Ca2 處理法 目的基因進入 內(nèi) 并且在受體細胞內(nèi)維持 和 的過程 受體細胞 穩(wěn)定 表達 1 將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點 易感染雙子葉植物和裸子植物 對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞 并整合到受體細胞染色體的DNA上 過程 優(yōu)點 經(jīng)濟 有效 2 基因槍法 3 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱游锛毎?方法 顯微注射法 程序 3 將目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物特點 繁殖快 單細胞 遺傳物質(zhì)少 方法 大腸桿菌 四 目的基因的檢測與鑒定 檢查是否成功 一 檢測 1 檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記 以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交 若顯示出雜交帶 表明染色體已插入染色體DNA中 1 方法 DNA分子雜交 2 過程 DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段 將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起 如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列 那么 互補的堿基序列就會結(jié)合在一起 形成雜合雙鏈區(qū) 在沒有互補堿基序列的部位 仍然是兩條游離的單鏈 歸納步驟 二 鑒定 個體生物學(xué)水平 2 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 3 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 方法 分子雜交 方法 抗原抗體雜交 過程 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交 若出現(xiàn)雜交帶 表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA 思考與探究 1 作為基因工程表達載體 只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎 為什么 不可以 因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用 還需要有其他控制元件 如啟動子 終止子和標(biāo)記基因等 必須構(gòu)建上述元件的主要理由是 1 生物之間進行基因交流 只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達 2 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子 只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄 2020 4 18 53 3 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記 4 為了增強目的基因的表達水平 往往還要增加一些其他調(diào)控元件 如增強子等 5 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位 往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因 或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因 如綠色熒光蛋白基因等 2020 4 18 54 思考與探究2 根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理 你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎 若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做 要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株 因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物 要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì) 一般為乙酰丁香酮等 目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏 趨化性 和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū) 誘導(dǎo) 的基因 使T DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上 2020 4 18 55 3 利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素 聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識 結(jié)合基因工程操作程序的基本思路 思考一下 若要生產(chǎn)人的糖蛋白 可以用大腸桿菌嗎 有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈 這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細胞中 大腸桿菌不存在這兩種細胞器 因此 在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的 思考與探究 2020 4 18 56 4 珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分 當(dāng)它的成分異常時 動物有可能患某種疾病 如鐮刀形細胞貧血癥 假如讓你用基因工程的方法 使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的 珠蛋白 想一想 應(yīng)如何進行設(shè)計 2020 4 18 57 1 從小鼠中克隆出 珠蛋白基因的編碼序列 cDNA 2 將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子 另外加上抗四環(huán)素的基因 構(gòu)建成一個表達載體 3 將表達載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中 然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌 如果表達載體未進入大腸桿菌中 大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉 如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落 則表明 珠蛋白基因已進入其