動(dòng)物細(xì)胞克隆研究進(jìn)展ppt課件.ppt

動(dòng)物細(xì)胞克隆研究的進(jìn)展 生物科學(xué)與工程學(xué)院 10級(jí)生物技術(shù) 1 班 郭柳 劉云森 張孟星 1 克隆的定義 克隆 clone 是指通過無性生殖而產(chǎn)生的遺傳上均一的生物群 即具有完全相同的遺傳組成的一群細(xì)胞或者生物的個(gè)體 克隆在希臘語(yǔ)中是 小樹枝葉 的意思 用以指無性增殖物 現(xiàn)在則指?jìng)€(gè)體 細(xì)胞 基因等不同水平上的無性增殖物 2 哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)主要包括五個(gè)步驟 1 供體核的準(zhǔn)備 2 受體細(xì)胞質(zhì)的選取 3 核質(zhì)重組融合 激活技術(shù) 4 重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng) 5 重組胚胎的移植 3 1供體核的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)證明 在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆中 并非一切體細(xì)胞都可作為供核細(xì)胞進(jìn)行核移植 胎兒成纖維細(xì)胞因在克隆前能進(jìn)行基因修飾 故目前大多數(shù)家畜的克隆都以它為供核細(xì)胞 另外 輸卵管及子宮上皮細(xì)胞 卵丘細(xì)胞 顆粒細(xì)胞 耳細(xì)胞等也可作為供核細(xì)胞 4 2受體細(xì)胞質(zhì)的選取 研究人員早期曾以受精卵或去核2 細(xì)胞胚作為受體卵 后期實(shí)驗(yàn)證明 成熟卵母細(xì)胞比受精卵或2 細(xì)胞胚更適合于用作核移植的受體細(xì)胞質(zhì) 它能使各個(gè)發(fā)育時(shí)期胚胎甚至體細(xì)胞核重新編程 近年來通常以第二次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞取代原核受體 解決核受體問題 5 3核質(zhì)重組融合 激活技術(shù) 研究人員早期主要以卵周隙注射法進(jìn)行核質(zhì)重組 由于在核質(zhì)重組過程中微吸管容易損壞卵膜及一部分細(xì)胞質(zhì) 成功率偏低 需對(duì)重組胚融合 融合法有 早前采用的仙臺(tái)病毒法激活核質(zhì) 隨后采用的電融合法 和近年來 人們普遍采用商業(yè)公司銷售的激活劑法 6 4重組胚的體內(nèi)或體外培養(yǎng) 重組胚胎激活后 有體內(nèi)和體外兩種培養(yǎng)方式 體內(nèi)培養(yǎng)是將激活的重組胚胎植入同種或異種動(dòng)物輸卵管中 經(jīng)數(shù)天后檢測(cè)發(fā)育正常的囊胚 然后進(jìn)行胚胎移植 體外培養(yǎng)是將激活后的重組胚在培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚 再挑選優(yōu)質(zhì)的胚胎移入到同步發(fā)情的同種雌性動(dòng)物輸卵管中 7 5重組胚胎的移植 在早期的研究中 為了提高胚胎的發(fā)育成功率 Campbell等采取了體內(nèi)培養(yǎng)技術(shù) 后來研究發(fā)現(xiàn) 該方法不僅成本高 而且并無多大的優(yōu)越性 Wells等人經(jīng)過技術(shù)改良 發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的核移植胚胎的囊胚率可達(dá)到正常的體外受精胚胎的水平 目前 重組胚移植到經(jīng)同期化處理的受體母畜中的程序 與常規(guī)胚胎移植相同 8 影響細(xì)胞克隆成功的因素 1體細(xì)胞核是否重新編程2體細(xì)胞的選擇3受體卵母細(xì)胞的選擇4去核方法5活化方法 9 1 體細(xì)胞是否重新編程 能否成功的進(jìn)行重編程決定了克隆的成功與否 核移植中重編程的重要過程 是將已分化的體細(xì)胞的DNA進(jìn)行甲基化扭轉(zhuǎn) 并重新建立 使其恢復(fù)為合子時(shí)的狀態(tài) 即表達(dá)胚胎發(fā)生過程中的基因 10 2 體細(xì)胞的選擇 2 1體細(xì)胞的細(xì)胞周期不同細(xì)胞周期的細(xì)胞其DNA含量不同 核移植后將決定重構(gòu)胚的倍性 11 2 2體細(xì)胞的類型 目前已誕生的多種克隆動(dòng)物來自不同類型的細(xì)胞 包括纖維細(xì)胞 皮膚細(xì)胞 輸卵管上皮細(xì)胞等 其克隆效率存在差異 這可能由于不同類型的細(xì)胞重編程的難易程度不同 12 3 受體卵母細(xì)胞的選擇 供體細(xì)胞經(jīng)核移植導(dǎo)入卵母細(xì)胞以后 緊接著發(fā)生核質(zhì)相互作用 核中的眾多因子被來自卵母細(xì)胞的因子所取代 因此 卵母細(xì)胞的選擇成為影響核移植效率的重要因素 其因素包括 3 1卵母細(xì)胞所處的時(shí)期3 2卵母細(xì)胞的活化情況3 3卵母細(xì)胞的來源 13 4 去核方法 快速而準(zhǔn)確的去核會(huì)避免孤雌發(fā)育 目前有三種去核方法 4 1盲去法4 2Hoechst3324顯示法4 3蔗糖顯示法 14 4 1盲去法 盲去法是較常用的去核方法 在剛排出的極體M2期卵母細(xì)胞上操作 用針將紡錘體和極體一起吸走 此方法簡(jiǎn)單易行 但去核時(shí)不徹底會(huì)造成孤雌生殖 15 4 2Hoechst3324顯示法 Hoechst3324是一種DNA的活性染料 卵母細(xì)胞經(jīng)其染色后 在紫外光激發(fā)下可清楚顯示紡錐體 從而準(zhǔn)確去核 此方法的缺點(diǎn)是紫外光照射會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞造成一定的損傷 進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 16 4 3蔗糖顯示法 將卵母細(xì)胞置于含蔗糖的操作液中 調(diào)節(jié)蔗糖濃度 卵母細(xì)胞的紡錘體會(huì)形成透明突起 然后可進(jìn)行去核操作 這種方法去核率達(dá)95 且吸取的胞質(zhì)很少 17 5活化方法 目前對(duì)活化方法的選擇主要集中在活化時(shí)間和活化劑上 18 5 1活化時(shí)間 融合后的活化時(shí)間主要有兩種 即時(shí)活化和延遲活化 現(xiàn)在普遍認(rèn)為延遲活化有利于核的重編程 19 5 2活化劑 目前選用的活化劑主要有離子霉素 放線菌酮 6 DMAP等 不同的活化劑的組合有不同的發(fā)育率 活化劑的選擇和活化方法上有不同的組合 隨物種的種類而定 20 6重構(gòu)胚的培養(yǎng)條件 目前傾向于認(rèn)為培養(yǎng)液中的血清和共培養(yǎng)影響了重構(gòu)胚的發(fā)育 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含血清 共培養(yǎng)的胚胎后代出生時(shí)體重明顯高于不含血清 非共培養(yǎng)的胚胎后代 且容易引起難產(chǎn) 另外 克隆胚胎與正常胚胎在培養(yǎng)條件的要求上有差異 使得克隆胚胎在生理和代謝上發(fā)生了一定的改變 這也可能是克隆胚胎發(fā)育率低的一個(gè)原因 21 7 種的差異 各種克隆動(dòng)物的出生率雖然都不超過3 但其難易程度有所不同 例如 牛和鼠克隆后代的異?，F(xiàn)象并未在克隆豬上出現(xiàn) 日本黑牛風(fēng)出生率高達(dá)19 這些都說明 物種間生理?xiàng)l件的不同也是影響克隆效率的因素 22 動(dòng)物細(xì)胞克隆成果展示 23 1996年 一只名叫多利的綿羊被成功克隆誕生 這只雌性綿羊一直存活了6年 這是世界上第一只被克隆的哺乳動(dòng)物 它被認(rèn)為是人類克隆研究領(lǐng)域上最大的成功 之后數(shù)以百計(jì)的類似多利的哺乳動(dòng)物被克隆出來 多莉綿羊 24 山羊米拉是在1998年克隆的 當(dāng)時(shí)它和自己的姐妹們是從美國(guó)實(shí)驗(yàn)室被制造出來 科學(xué)家利用家畜克隆技術(shù)生產(chǎn)對(duì)人體有益的藥物成份 山羊米拉 25 這兩頭母牛是在1998年被成功克隆的 隨后克隆了數(shù)千頭母牛 這是日本克隆技術(shù)上的最大成果 這項(xiàng)技術(shù)也為其他克隆技術(shù)生產(chǎn)出更好的肉質(zhì)和牛奶做出巨大貢獻(xiàn) 母牛諾托和卡加 26 美國(guó)實(shí)驗(yàn)室引入基因改良豬 使這些克隆豬能夠生長(zhǎng)出適合人類的器官和細(xì)胞組織 此次一共克隆了5頭雌性豬 其中最大的一頭叫做米莉 它們是2000年美國(guó)一家生物公司成功克隆的 克隆豬 27 2000年 實(shí)驗(yàn)室首次成功克隆了一只叫做特拉的獼猴 后來科學(xué)家們陸續(xù)克隆了多只猴子 可用于研究人員測(cè)試糖尿病等病癥 獼猴特拉 28 2000年 科學(xué)家在美國(guó)夏威夷成功克隆一只老鼠 這只老鼠被命名為 庫(kù)姆利納 Cumulina 它一直存活了兩年7個(gè)月 據(jù)悉 這在克隆研究領(lǐng)域是一項(xiàng)重大突破 老鼠庫(kù)姆利納 29 2000年 一只叫做奧姆布雷塔的歐洲盤羊被成功克隆 科學(xué)家這樣做是為了營(yíng)救目前世界上數(shù)目稀少的歐洲盤羊 避免它們從地球上滅絕消失 歐洲盤羊奧姆布雷塔 30 這只名叫科畢的貓于2001年成功克隆 從此開辟了寵物克隆市場(chǎng) 并最終形成了克隆寵物的國(guó)際性行業(yè) 克隆貓科畢 31 2001年 科學(xué)家成功克隆出兔子 如圖所示 他們克隆的兔子是純白色 之后科學(xué)家陸續(xù)克隆了30多只兔子 兔子 32 2001年 一只叫做諾亞的亞洲野牛被成功克隆 據(jù)悉 近年來亞洲野牛的數(shù)量銳減 諾亞由于痢疾只存活了兩天 野牛諾亞 33 2002年 一只叫做拉夫爾的大老鼠終于成功地被克隆 據(jù)悉 它經(jīng)過15次克隆才最終成功 雖然像拉夫爾這樣的大老鼠最終可能用于實(shí)驗(yàn)室研究 但是大老鼠的克隆技術(shù)較難實(shí)現(xiàn) 并且大老鼠的克隆對(duì)于人類醫(yī)學(xué)研究意義重大 老鼠拉夫爾 34 2003年 美國(guó)德克薩斯州農(nóng)業(yè)機(jī)械大學(xué)成功克隆了一只白尾鹿 并取名為杜威 雖然它的家族成員存在于北美洲地區(qū)多次動(dòng)物克隆實(shí)驗(yàn) 但科學(xué)家們?nèi)圆恍高M(jìn)行克隆鹿實(shí)驗(yàn) 其目的是用于研究鹿基因 并形成更好的鹿基因 克隆鹿杜威 35 雖然目前非洲野貓并未滅絕 但2003年美國(guó)科學(xué)家還是克隆出了非洲野貓 作為克隆其他更容易出現(xiàn)數(shù)量驟減的物種樣本 非洲野貓迪特尤克斯 36 2003年 意大利一支研究小組克隆出一只叫做普羅梅亞的種馬 他們希望通過克隆的方法能夠制造出更多的意大利種馬 但是這項(xiàng)嘗試失敗了 克隆馬普羅梅蒂亞 37 騾子是不能生育的 除非采用克隆技術(shù) 2003年 美國(guó)愛達(dá)荷州研究小組成功地克隆了一只叫做格姆的騾子 據(jù)悉 它不僅是第一只被成功克隆的馬科動(dòng)物 而且它也是第一只被克隆的無法生育的動(dòng)物 騾子格姆 38 2004年 美國(guó)依阿華大學(xué)首次成功克隆出雪貂利比和利麗 這對(duì)于研究呼吸管疾病非常有用 同時(shí)雪貂也是瀕危滅絕的物種 雪貂利比和利麗 39 2005年 韓國(guó)科學(xué)家挑戰(zhàn)了一項(xiàng)克隆技術(shù) 最終他們利用干細(xì)胞移植手術(shù)培育出世界上第一只克隆狗 并將這只克隆狗命名為史努比 據(jù)悉 科學(xué)家利用干細(xì)胞移植手術(shù)培育方法可用于研究人類疾病 克隆狗史努比 40 2005年 首爾國(guó)立大學(xué)宣布成功地克隆了兩只灰狼 這是保護(hù)環(huán)境和野生動(dòng)物的一種有效措施 克隆狼 41 克隆利和弊 利 1 克隆實(shí)驗(yàn)的實(shí)施促進(jìn)了遺傳學(xué)的發(fā)展 為 制造 能移植于人體的動(dòng)物器官開辟了前景 2 克隆技術(shù)可用于檢測(cè)胎兒的遺傳缺陷 將受精卵克隆用于檢測(cè)各種遺傳疾病 克隆的胚胎與子宮中發(fā)育的胎兒遺傳特征完全相同 42 3 克隆技術(shù)可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷 成年人的神經(jīng)組織沒有再生能力 但干細(xì)胞可以修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷 4 在體外受精手術(shù)中 醫(yī)生常常需要將多個(gè)受精卵植入子宮 從中篩選一個(gè)進(jìn)入妊娠階段 但許多女性只能提供一個(gè)卵子用于受精 通過克隆可以很好地解決這一問題 43 弊 1 克隆將減少遺傳變異 通過克隆產(chǎn)生的個(gè)體具有同樣的遺傳基因 同樣的疾病敏感性 一種疾病就可以毀滅整個(gè)由克隆產(chǎn)生的群體 2 克隆技術(shù)的使用將使人們傾向于大量繁殖現(xiàn)有種群中最有利用價(jià)值的個(gè)體 而不是按自然規(guī)律促進(jìn)整個(gè)種群的優(yōu)勝劣汰 從這個(gè)意義上說 克隆技術(shù)干擾了自然進(jìn)化過程 44 3 克隆技術(shù)是一種昂貴的技術(shù) 需要大量的金錢和生物專業(yè)人士的參與 失敗率非常高 4 克隆技術(shù)應(yīng)用于人體將導(dǎo)致對(duì)后代遺傳性狀的人工控制 克隆技