魚腥草莖在不同時(shí)期多糖含量比較學(xué)士學(xué)位論文.doc

本科畢業(yè)論文 （設(shè)計(jì)）( 2013屆 ) 題 目： 魚腥草莖在不同時(shí)期多糖含量比較 學(xué) 院： 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 專 業(yè)： 生物科學(xué) 學(xué)生姓名： 張忠亮 學(xué)號(hào)： 20909041084 指導(dǎo)教師： 余利華 職稱（學(xué)位）： 工程師（碩士） 合作導(dǎo)師： 陳向陽 職稱（學(xué)位）： 講 師（碩士） 完成時(shí)間： 2013 年 5 月 25 日 成 績： 綜合成績： 等級(jí)： 黃山學(xué)院教務(wù)處制第 15 頁 共 15 頁學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明茲呈交的學(xué)位論文，是本人在指導(dǎo)老師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考的其他個(gè)人或集體的研究成果，均在文中以明確方式標(biāo)明。本人依法享有和承擔(dān)由此論文而產(chǎn)生的權(quán)利和責(zé)任。聲明人（簽名）：2013年 6 月 1 日目 錄中文摘要英文摘要1引言51.1魚腥草簡介51.2魚腥草的研究價(jià)值51.3超聲波的作用原理52材料儀器和實(shí)驗(yàn)方法62.1材料儀器準(zhǔn)備62.1.1材料的準(zhǔn)備和處理62.1.2實(shí)驗(yàn)試劑62.1.3實(shí)驗(yàn)器材62.2試驗(yàn)方法62.2.1多糖含量測定原理62.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制62.2.3魚腥草的脫脂脫色72.2.4單因子實(shí)驗(yàn)72.2.5正交試驗(yàn)92.2.6不同時(shí)期多糖的測量93實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析104.1標(biāo)準(zhǔn)的繪制104.2單因素實(shí)驗(yàn)114.3正交實(shí)驗(yàn)114.4不同時(shí)期多糖的測量124討論13參考文獻(xiàn)14致謝14魚腥草莖在不同時(shí)期多糖含量比較張忠亮（20909041084）導(dǎo)師：余利華（工程師）合作導(dǎo)師：陳向陽（講師）（黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，黃山學(xué)院）摘要：先分別通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)魚腥草莖中的多糖進(jìn)行超聲波提取，以魚腥草提取率作為指標(biāo)，分別對(duì)超聲波浸提時(shí)間，水浴時(shí)間，水浴溫度以及乙醇濃度這些因素進(jìn)行考察，從而得出超聲波提取魚腥草莖中多糖的最好條件：超聲波浸提時(shí)間30min，水浴時(shí)間90min，水浴溫度80，乙醇濃度80%。然后在最佳條件下分別測四個(gè)不同時(shí)期下魚腥草莖中多糖的提取率，從而得出魚腥草莖中多糖在6月份含量比較豐富。關(guān)鍵詞：魚腥草；多糖；單因素；正交；超聲波；不同時(shí)期Houttuynia cordata stems in the polysaccharide content in different periods Zhong-Liang ZHANG（20909041084）Supervisor: Li-Hua YU(Engineer)Co-supervisor:Xiang-Yang CHEN(Lecturer)(College of Life and Environment sciences, Huangshan University, Huangshan, 245041 China)Abstract:first by single factor experiment and orthogonal experiment for ultrasonic extraction of polysaccharide of Houttuynia cordata stems, rate as the index in Houttuynia cordata extraction, ultrasonic extraction time of time, water bath, water bath temperature and ethanol concentration on these factors, then the best extraction conditions of polysaccharide in Houttuynia cordata stems: ultrasonic ultrasonic the extraction time, water bath time, water bath temperature, ethanol concentration. The extraction rate and then under the optimal conditions were measured at four different times of H. cordata stems polysaccharide, thus draws cordata stems polysaccharides rich in content.Key Words: Houttuynia cordata; polysaccharide; single factor; orthogonal; ultrasonic; different periods 1 引言 1.1 魚腥草特點(diǎn) 魚腥草（Houttuynia cordata） 又名側(cè)耳根，魚鱗草等，是三白草科（Saururacere）蕺菜屬(Houttuynia),是很常用中草藥。為多年生草本植物，高3050厘米，常呈紫紅色，下部伏地蔓生、生根，節(jié)上輪生小根。因其含有魚腥氣味，故而得名魚腥草。魚腥草生長于陰濕處或山澗邊，?？稍谝暗亍⒙放?、庭園樹下等較陰濕的地方發(fā)現(xiàn)，大片蔓生。該植物我國南方各地較常見。魚腥草內(nèi)含有黃酮，蛋白質(zhì)，多糖等等。由于多糖有多種生物活性，與生物機(jī)能的維持密切相關(guān)，各種植物多糖有很多的藥理作用藥理研究表明魚腥草具有：抗菌作用，抗病毒作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，利尿作用抗炎抗過敏作用。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，魚腥草水溶性多糖多葡萄球菌，變形桿菌，大腸桿菌，沙門氏菌有不同的抑菌效果，七對(duì)雙歧桿菌有促增效果2。其獨(dú)特的功能和低毒性有很廣的前景。 1.2 魚腥草的研究價(jià)值 魚腥草含有比較豐富的藥用成分和營養(yǎng)成分，是一種藥食兼用的野生植物，具有清熱解毒，利尿消腫。治肺炎，肺膿瘍，熱痢，白帶，癰腫，禿瘡，疥癬等功效12。其富含人體所需的蛋白質(zhì)，脂肪，鈣，維生素C和維生素E等營養(yǎng)成分。其主要含有的是揮發(fā)油和黃酮類。這些方面已有很多人做過相關(guān)的研究。而多糖是對(duì)人類很重要的化合物，人們從內(nèi)到外都離不開它，而其多糖低毒性的性質(zhì)也很值得去了解。本實(shí)驗(yàn)主要是借助超聲波對(duì)不同魚腥草莖內(nèi)的多糖進(jìn)行提取分析。進(jìn)而分析出不同時(shí)期魚腥草莖中多糖含量最為豐富的時(shí)期。為更高效的利用魚腥草提供一定理論依據(jù)。1.3 超聲波的作用原理超聲波提取是很高效的一種強(qiáng)化提取效果的方法1,2,5,8。主要是利用超聲波所產(chǎn)生的超聲能，強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)。當(dāng)超聲波振動(dòng)時(shí)，產(chǎn)生很大的能量，從而引起媒質(zhì)以很大的速度進(jìn)入加速的振動(dòng)狀態(tài)。使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使有效成分進(jìn)入溶劑中。除此之外，超聲波還在液體中國產(chǎn)生空化作用，而且伴隨強(qiáng)大的沖擊波和微聲波，以致細(xì)胞壁被破壞，植物內(nèi)的物質(zhì)成分會(huì)釋放出來從而會(huì)提高相應(yīng)物質(zhì)的提取率。除此之外，超聲波還有些像熱效應(yīng)，乳化等等，也會(huì)相應(yīng)的提高物質(zhì)的提取率5,15。2 材料儀器和實(shí)驗(yàn)方法 2.1. 1 材料的準(zhǔn)備和處理魚腥草是分不同時(shí)期（2012年4月20日,5月3日，5月28日，6月10日）在黃山學(xué)院南區(qū)內(nèi)挖得，洗凈后將根莖葉分開取莖，放入干燥相中恒溫70干燥24小時(shí)，直至恒重，然后在粉碎機(jī)中粉碎放置在干燥的地方備用。2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑95%乙醇（上海振企化學(xué)試劑有限公司），濃硫酸（上海振企化學(xué)試劑有限公司），葡萄糖（天津博迪化工股份有限公司），石油醚（新隴化工股份有限公司），乙醚（揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水，蒽酮（上?？曝S化學(xué)試劑有限公司）。2.1.3 實(shí)驗(yàn)器材微型植物試樣粉碎機(jī) (金壇市杰瑞爾電器有限公司 ) ；電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（上海奧普勒儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（曙峰企業(yè)制造）；索氏提取器（上海新嘉電子有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮有限公司產(chǎn)品)；粉碎機(jī)；試管；量筒；燒杯；容量瓶等。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2. 1 多糖含量測定原理利用苯酚-濃硫酸法測定多糖的含量3，因多糖在濃硫酸作用下，分子內(nèi)脫水生成羥甲基糠醛或者羥甲基糠醛，其與苯酚縮合生成一種橙紅色化合物，在490nm波長下有最大的吸收峰，所以可以用比色法在此波長下測定吸光度2，進(jìn)而算出多糖的含量。此法靈敏度高，基本不受蛋白質(zhì)的存在干擾。而本次試驗(yàn)的基本流程是：材料的脫脂脫色，干燥，精確稱量，加酒精，超聲波浸提，水浴加熱，靜置，過濾取上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，靜置，離心，取沉淀物加蒸餾溶解水并加熱，過濾去除雜質(zhì)，然后醇析離心，得到粗多糖，再定溶，最后按照苯酚-濃硫酸法測相應(yīng)多糖的吸光度A值2,15，進(jìn)而得出結(jié)論。2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3,9利用電子天平精密稱取干燥張致恒重的葡萄糖0.0966g加水溶解至100ml,然后再取1ml定容至10ml容量瓶中，制的0.0966mg/ml的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。取11支試管按0到11編號(hào)，0號(hào)作對(duì)照；1,2號(hào)加0.20ml葡萄糖儲(chǔ)備液；3,4號(hào)加0.40ml葡萄糖儲(chǔ)備液；5,6號(hào)加0.60ml葡萄糖儲(chǔ)備液；7,8號(hào)加0.80ml葡萄糖儲(chǔ)備液；9,10號(hào)加1.00ml葡萄糖儲(chǔ)備液；然后將0到10號(hào)全部加蒸餾水定容至2.00ml；然后按照順序向試管中加入1.00ml的9%的苯酚溶液和5.00ml的濃硫酸（濃硫酸加入一定要緩慢），搖勻，靜置30分鐘。最后以0號(hào)試管為參照，在490nm波長下測吸光度A值3,9。做好登記，以橫坐標(biāo)為糖含量，吸光度A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸的的求解見圖3-1。 2.2.3 魚腥草粉末的脫脂脫色將不同時(shí)期的魚腥草莖用電子天平精確稱各取6包，每包1g，再稱任一時(shí)期的材料9包，均用濾紙包好并做好標(biāo)記。然后在索氏提取器中用石油醚脫脂脫色4小時(shí)，提取溫度恒定在70。然后取出放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70下干燥12個(gè)小時(shí)以上，使之達(dá)到恒重。之后放入干燥箱中作為實(shí)驗(yàn)材料。脫脂脫色對(duì)其多糖的提取是很重要的步驟，脂類和色素的存在是很影響多糖的測定的，所以脫脂脫色要充分。2.2.4 單因子實(shí)驗(yàn)每次實(shí)驗(yàn)均取同一時(shí)期的“2.2.3”中的材料四包，即每次取同一時(shí)期的4克，分別放入4個(gè)試管中，按下圖表2-1，表2-2，表2-3和表2-4中依次編號(hào)，每支試管中均加20ml的乙醇，并且按下面表格添加試劑和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)13,15。表2-1 乙醇濃度的選擇實(shí)驗(yàn)table 2-1 Choice experiment ethanol concentration實(shí)驗(yàn)條件試管編號(hào)1.11.21.31.4乙醇濃度60%70%80%90%水浴溫度70707070水浴時(shí)間30min30min30min30min超聲波浸提時(shí)間30min30min30min30min表2-2 水浴溫度選擇的實(shí)驗(yàn)Table 2-2 bath temperature selection experiment實(shí)驗(yàn)條件試管編號(hào)2.12.22.32.4乙醇濃度70%70%70%70%水浴溫度60708090水浴時(shí)間30min30min30min30min超聲波浸提時(shí)間30min30min30min30min表2-3 水浴時(shí)間選擇的實(shí)驗(yàn)Table 2-3 bath time selection experiment實(shí)驗(yàn)條件試管編號(hào)3.13.23.33.4乙醇濃度70%70%70%70%水浴溫度60708090水浴時(shí)間30min60min90min120min超聲波浸提時(shí)間30min30min30min30min表2-4 超聲波浸提時(shí)間的選擇實(shí)驗(yàn)table 2-4 Choice experiment ultrasonic extraction time實(shí)驗(yàn)條件試管編號(hào)4.14.24.34.4乙醇濃度70%70%70%70%水浴溫度60708090水浴時(shí)間30min30min30min30min超聲波浸提時(shí)間30min45min60min75min 然后靜置過濾取上清液，濾液在RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，在靜置12小時(shí)，在離心機(jī)中以3000r/min離心30min,然后沉淀物溶于蒸餾水中，加熱去除不溶物，醇析離心，得到魚腥草粗多糖，最后按照“2.2.2”中的苯酚-濃硫酸法2在紫外可見分光光度計(jì)（490nm）中分別測其吸光度A值，作好記錄。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制作表格見圖3-2。2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)1,3,7,12在單因素的基礎(chǔ)之上選擇不同的乙醇濃度，水浴時(shí)間，水浴溫度和超聲波浸提時(shí)間為條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，取“2.2.3”中單獨(dú)處理的16包材料為實(shí)驗(yàn)材料，分別放入16支試管中依次編號(hào)1到9號(hào)，加入的各梯度的酒精均為20ml。以確定魚腥草的最佳提取工藝其各條件的試驗(yàn)情況見表2-5。表2-5 正交實(shí)驗(yàn)各因素的條件Table 2-5 factors orthogonal experiment conditions 條件 編號(hào) 超聲波浸提時(shí)間（min）水浴時(shí)間（min）水浴溫度（）乙醇濃度（%）5.1306070705.2309080805.33012090905.4456080905.5459090705.64512070805.7606090805.8609070905.9601208070然后靜置過濾取上清液，濾液在RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，在靜止12小時(shí)，在離心機(jī)中以3000r/min離心30min,然后沉淀物溶于蒸餾水中，加熱去除不溶物，醇析離心，得到魚腥草粗多糖，最后按照“2.2.2”中的苯酚-濃硫酸法2在紫外可見分光光度計(jì)中分別測其吸光度A值，作好記錄。制作表格見圖3-3。2.2.6 不同時(shí)期多糖含量的測定 在單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇最佳的實(shí)驗(yàn)條件，即乙醇濃度80%，水浴溫度80%，水浴時(shí)間90min和超聲波浸提時(shí)間30min。分別取各個(gè)時(shí)期的“2.2.3”中的材料各一包，分別放入4支試管中，依次編號(hào)6.1，6.2，6.3，6.4對(duì)應(yīng)的魚腥草莖的日期為4月20日，5月3日，5月28日，6月10日。和上面一樣加入酒精的體積也為20ml然后按照表2-6進(jìn)行操作。表2-6 不同時(shí)期多糖含量測定的實(shí)驗(yàn)Table 2-6 determination of polysaccharide content in different periods of experimenttable 條件 編號(hào) 乙醇濃度（%）水浴溫度（）水浴時(shí)間（min）超聲波浸提時(shí)間(min)6.1808090306.2808090306.3808090306.48080903然后靜置過濾取上清液，濾液在RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，在靜止12小時(shí)，在離心機(jī)中以3000r/min離心30min,然后沉淀物溶于蒸餾水中，加熱去除不溶物，醇析離心，得到魚腥草粗多糖，最后按照“2.2.2”中的苯酚-濃硫酸法2在紫外可見分光光度計(jì)中分別測其吸光度A值，作好記錄，根據(jù)數(shù)據(jù)制作表格見圖3-3。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表3-1 葡萄的糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 Grape 3-1 Glucose standard 圖3-1所示標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=1.5312X+o.0006,R=0.9906其吸光度與濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。 3.2 單因素實(shí)驗(yàn) 圖3-2 魚腥草莖部多糖提取單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 Grape 3-2 Extraction of single factor experiment results polysaccharidecordata stems. 由單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出在固定三個(gè)變量恒定的情況下，吸光度最大，即魚腥草莖部多糖的提取率最大的條件為乙醇溶液的濃度為80%，水浴溫度為80，水浴時(shí)間為120min，超聲波浸提時(shí)間為45min。3.3 正交實(shí)驗(yàn) 表3-1 魚腥草莖部多糖提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果3,16，7table 3-1 Results of orthogonal test Houttuynia cordata stems polysaccharide extraction 條件 編號(hào) 超聲波浸提時(shí)間（min）水浴時(shí)間（min）水浴溫度（）乙醇濃度（%）提取率mg/g5.1306070703.8615.2309080806.0235.33012090904.7265.4456080903.7545.5459090705.4565.64512070804.3785.7606090802.7655.8609070905.3975.96012080704.345K14.7803.4604.5454.554K24.5315.6274.7074.389K34.1694.4834.3164.631R0.6112.1670.3910.242由表3-1 魚腥草莖部多糖提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知對(duì)魚腥草莖部多糖提取率影響的主要因素依次為：水浴時(shí)間超聲波浸提時(shí)間水浴溫度乙醇濃度；而提取率最佳的組合為:超聲波浸提時(shí)間為30min，水浴時(shí)間為90min，水浴溫度為80，乙醇濃度為80%；在這個(gè)組合的條件下其魚腥草莖部的提取率為6.023mg/g。 3.4 不同時(shí)期多糖的測定 圖3-3 不同時(shí)期魚腥草莖部多糖提取測定圖Grape 3-3 Determination of Fig.in different periods of Houttuynia cordata stems to extract polysaccharide 由圖3-2可以看出6月10日的魚腥草吸光度最大，所以相對(duì)其他時(shí)期而言其莖部多糖的含量比較豐富。4 討論本次試驗(yàn)通過單因子實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)對(duì)魚腥草莖部多糖的提取率的四個(gè)影響因子進(jìn)行比較分析，選擇出組合搭配最佳的一組，即為乙醇濃度80%，水浴溫度80，水浴時(shí)間80min和超聲波浸提時(shí)間30min。在這個(gè)組合下經(jīng)過對(duì)不同時(shí)期魚腥草莖部的多糖含量進(jìn)行比較可知，6月份的多糖含量比較高。這次的實(shí)驗(yàn)只考慮了四個(gè)剛面的單因子，其實(shí)影響多糖的提取率的因素還有許多，比如料液比，超聲波的頻率等等，要想更佳全面準(zhǔn)確的分析魚腥草多糖的提取率，這些因素都是不可以忽略的。就本實(shí)驗(yàn)而言是比較不同時(shí)期的含量的大小，所以不是那么重要。從整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程核試驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)論來看，整個(gè)四個(gè)時(shí)期多糖含量并未表現(xiàn)出怎樣的規(guī)律，而且多糖含量之間的差異也很小，這樣的結(jié)果可能有多方面的原因。首先，從材料的獲取上魚腥草四個(gè)時(shí)期間隔的太短，在時(shí)間上并不能體現(xiàn)出差距，材料采集的時(shí)期上也沒有季度上的跨度，因而多糖含量的變化并不是表現(xiàn)得很明顯。另一方面，在材料的獲取上，是在黃山學(xué)院南區(qū)，但并不是同一個(gè)地方挖取得，各個(gè)地方的土地環(huán)境光等等照條件不一樣，所以魚腥草長勢(shì)的條件差異很大，這也是對(duì)其含量影響比較大的因子。從圖3-3來看，6月份以后魚腥草莖部多糖的含量可能還會(huì)上升。所以要更明顯有效測定魚腥草莖部多糖含量的情況，應(yīng)將時(shí)間跨度拉大，并且側(cè)更多的時(shí)期而且魚腥草的來源應(yīng)相同。從單因子實(shí)驗(yàn)到正交實(shí)驗(yàn)中，我們可以明顯的看到，在單因子試驗(yàn)中各個(gè)提取率最高的的影響因子的組合，并不是正交試驗(yàn)的最佳組合。各個(gè)影響因子對(duì)多糖提取率的影響是有大小的從，本實(shí)驗(yàn)表3-1看出對(duì)魚腥草莖部多糖的提取影響從大到小為水浴時(shí)間，超聲波浸提時(shí)間，水浴溫度和乙醇濃度。而只有在最佳的組合水浴時(shí)間90min，水浴溫度80，超聲波浸提時(shí)間30min，和乙醇濃度為80%條件下達(dá)到最大的提取率。而在多糖提取的過程中超聲波的作用是關(guān)鍵的，它破壞細(xì)胞，改變植物組織，發(fā)揮它像空化作用等特殊的作用加速以及提高物質(zhì)的釋放，同時(shí)在有效的保持有效成分活性的同時(shí)又減少像蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出，影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所以超聲波法提取多糖是一種不錯(cuò)的方法。參考文獻(xiàn)1 孟江，周毅生，廖華為.超聲波提取魚腥草多糖工藝研究.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，2008，19（1）：17-182張倩，江萍，秦禮康，等.魚腥草水溶性多糖的提取及鑒定.食品科學(xué)，2000，21（3）：49-503羅馨，趙衛(wèi)星，溫普紅.正交超聲法提取魚腥草多糖工藝研究.化學(xué)工程師，2012,09:10-154楊立紅，林劍，黃清榮，等.阿魏菇深層發(fā)酵菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化