熒光PCR熔解曲線(xiàn)原理

熔解曲線(xiàn)耐藥結(jié)核檢測(cè)技術(shù)的原理及應(yīng)用 隨著抗結(jié)核藥物的廣泛使用 耐多藥結(jié)核病人不 斷增加 耐多藥結(jié)核病 multidrug resistant tuberculosis MDR TB 是指至少同時(shí)對(duì)利福平 rifampin RIF 和異煙肼 isoniazid INH 這 兩種一線(xiàn)抗結(jié)核藥物耐藥 傳統(tǒng)的藥物敏感實(shí)驗(yàn) Drug susceptibility test DST 時(shí)間長(zhǎng) 不利于耐 多藥結(jié)核病患者的及時(shí)診治 因此 發(fā)展一種快速 檢測(cè)耐多藥結(jié)核病的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)于耐多藥 結(jié)核病的早期診斷和治療十分重要 一 熔解曲線(xiàn)耐藥結(jié)核檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展 結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒和結(jié)核 分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒于 2013 年 1 月 獲頒國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 SFDA 醫(yī)療器械注 冊(cè)證書(shū) 同時(shí) 中國(guó) 比爾蓋茨基金會(huì) 已將該 試劑盒納入該基金會(huì) 2013 年產(chǎn)品驗(yàn)證目錄 2016 年 9 月 SFDA 批準(zhǔn)了另外三種試劑盒 結(jié)核分枝 桿菌氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥突變檢測(cè)試劑盒 結(jié)核 分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測(cè)試劑盒 和 結(jié)核分枝 桿菌乙胺丁醇耐藥突變檢測(cè)試劑盒 分別用于檢測(cè) 結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物 鏈霉素藥物和乙胺 丁醇藥物耐藥性 可用于臨床上結(jié)核病的輔助診斷 這些產(chǎn)品上市 有利于對(duì)耐多藥結(jié)核病患者及時(shí)診治 從而更好地控制與治療結(jié)核病 二 熔解曲線(xiàn)耐藥結(jié)核檢測(cè)的工作原理 結(jié)核分枝桿菌異煙肼 利福平 氟喹諾酮 鏈霉素 乙胺丁醇耐藥突變檢 測(cè)試劑盒均采用熒光 PCR 熔解曲線(xiàn)法進(jìn)行檢測(cè) 熒光 PCR 熔解曲線(xiàn)法是一種簡(jiǎn)單快速的 PCR 檢測(cè)技術(shù) 其主要檢測(cè)原理為耐藥基因的基因突變會(huì)導(dǎo)致 DNA 雙鏈的結(jié)合力下降 從而導(dǎo)致相應(yīng)的 DNA 熔解溫度 Tm 值 下降 即野生型基因有特定的 Tm 值 而突變型基因因?yàn)榻Y(jié)合能力下降導(dǎo)致 Tm 值發(fā)生變化 1 Tm 值下降的幅度與發(fā)生錯(cuò)配的堿 基數(shù)目 類(lèi)型和位置有關(guān) 據(jù)此可以區(qū)分和檢測(cè) 出突變型和野生型 三 熔解曲線(xiàn)耐藥結(jié)核檢測(cè)產(chǎn)品結(jié)構(gòu) 結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒包含 擴(kuò)增試 劑 PCR Mix A PCR Mix B及 TB 酶混合液 對(duì) 照試劑 陽(yáng)性對(duì)照 含四個(gè)野生型擴(kuò)增靶基因的 質(zhì)粒 TB 陰性對(duì)照 不含靶基因的溶液 四 熔解曲線(xiàn)耐藥結(jié)核檢測(cè)的突變位點(diǎn) 2 抗結(jié)核 藥物 檢測(cè)的突變位點(diǎn) RFPrpoB 507 534 核心區(qū)位點(diǎn) INHahpC 啟動(dòng)子區(qū) 44 30 以及 15 3 位 點(diǎn) inhA94 密碼子 inhA 啟動(dòng)子區(qū) 17 8 位點(diǎn) 以及 katG315 密碼子 EMBembB306 embB378 380 embB406 及 embB497 四個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn) SMrpsL43 rpsL88 密碼子 rrs513 517 位點(diǎn) 和 rrs905 908 位點(diǎn) 五 熔解曲線(xiàn)耐藥結(jié)核檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn) 熔解曲線(xiàn)檢測(cè)試劑盒是目前市場(chǎng)上檢測(cè)項(xiàng)目最齊全的試劑盒 可實(shí)現(xiàn) MDR 和 XDR 一步檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)全程采用閉管法操作 無(wú) PCR 后處理 降低了擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染的 發(fā)生率 3 檢測(cè)時(shí)間較短 在 3 小時(shí)內(nèi)完成 可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)判讀 可在現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析儀上操作 不需要昂貴的專(zhuān)用設(shè)備 熔解曲線(xiàn)法與現(xiàn)有其他檢測(cè)方法相比 檢測(cè)項(xiàng)目 更為齊全 并且可在 3h 左右獲得藥敏結(jié)果 適用于 耐多藥結(jié)核病的快速篩查 有利于更快的對(duì)耐多藥患 者進(jìn)行診斷治療并減少耐多藥患者的傳播 這種檢測(cè) 方法對(duì)于我國(guó)結(jié)核病患者和結(jié)核病策略的影響還需要 進(jìn)行大范圍的 進(jìn)一步的調(diào)查研究 參考文獻(xiàn) 1 蔡挺 李巧云 張順 等 基因芯片技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)革蘭陰性桿菌 耐藥基因的 研究 J 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志 2011 21 21 4411 4414 2 嚴(yán)虹 施旭東 胡春梅 等 探針熔解曲線(xiàn)法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌利福平 異煙肼 乙胺丁醇及鏈霉素耐藥突變 臨床檢驗(yàn)雜志 2015 33 10 729 733 3 Qiu YH Zan ZL Yi QL et al Multiplex fluorescence melting curve analysi