熒光定量PCR應(yīng)用中的問(wèn)題及優(yōu)化方案.doc

實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用中的問(wèn)題及優(yōu)化方案聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction , PCR）自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測(cè)核酸分子的定性方法，而且也是一個(gè)能對(duì)核酸分子進(jìn)行精確定量的有力工具1。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，不僅建立了一系列的方法，而且也誕生了許多與這些方法相匹配的新型熱循環(huán)儀和實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種具有革命性意義的定量PCR技術(shù)，所謂實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè) 熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量2。目前它作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關(guān)鍵詞的文章就達(dá)一千多篇。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)較之與以前的以終點(diǎn)法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。首先，它不僅操作簡(jiǎn)便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，大大降低了污染的可能性并且無(wú)須在擴(kuò)增后進(jìn)行操作。另外，它還可以通過(guò)不同的引物設(shè)計(jì)在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因分子進(jìn)行擴(kuò)增，即多重?cái)U(kuò)增3,4,5。本文將對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR目前的應(yīng)用狀況、儀器應(yīng)用、新材料進(jìn)展以及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化作一綜述。實(shí)時(shí)定量PCR的應(yīng)用現(xiàn)狀實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)自1996年誕生以來(lái)，由于它顯著的優(yōu)越性，不僅廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，而且也開(kāi)始作為一種診斷手段應(yīng)用于臨床。其應(yīng)用涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析，基因突變分析等多個(gè)領(lǐng)域3。Giulietti 等人6對(duì)用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定細(xì)胞因子基因的表達(dá)作了詳細(xì)的描述。細(xì)胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白，它對(duì)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的關(guān)系。由于所得到組織樣本常常因?yàn)樘《荒軡M足在蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)，另外，通常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法（如ELISA）的靈敏度也難以完成對(duì)極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測(cè)，所以應(yīng)用PCR定量進(jìn)行基因診斷就顯得十分有意義。 眾所周知，cDNA微排列和差異表達(dá)PCR技術(shù)是對(duì)基因表達(dá)變化分析的兩種關(guān)鍵技術(shù)，但是這兩種技術(shù)只能對(duì)基因表達(dá)變化進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析。Rajeevan等人7利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)卻成功地將基因表達(dá)的變化進(jìn)行了量化，不僅有效地證明了上述兩種方法的有效性，而且提供了一種具有高通量的對(duì)基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)的新技術(shù)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)不僅增強(qiáng)了有關(guān)對(duì)基因量變化的研究方法，而且也增強(qiáng)了對(duì)基因質(zhì)所發(fā)生變化方面的研究。例如Laird和他的同事們8建立了一種被稱作Methylight的實(shí)時(shí)定量PCR方法，它能通過(guò)特異的引物和/或Taqman探針檢測(cè)基因CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生了甲基化。由于實(shí)時(shí)PCR的敏感性和特異性，使得這種方法對(duì)胞嘧啶的過(guò)度甲基化常常具有極高的靈敏度。最近有研究表明這種方法可以從食管癌病人的食管粘膜中檢出含有發(fā)生了過(guò)度甲基化基因的細(xì)胞9。又如Sevall等人10證明可以用實(shí)時(shí)定量PCR方法區(qū)分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記Taqman探針，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發(fā)生雜交，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交決定的，所以如果出現(xiàn)一種信號(hào)強(qiáng)于另一種信號(hào)則表明兩條基因具有同源性，若兩種信號(hào)都增強(qiáng)則表明為異源性。目前實(shí)時(shí)定量PCR在臨床診斷方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在對(duì)感染組織或細(xì)胞負(fù)載病毒的定量測(cè)定上，這一技術(shù)對(duì)DNA和RNA病毒都可以檢測(cè)，目前已有標(biāo)準(zhǔn)的操作手冊(cè)供人們使用，但是必須明確，國(guó)際上既沒(méi)有統(tǒng)一的病毒荷載的標(biāo)準(zhǔn)，也存在著對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量準(zhǔn)確性的各種爭(zhēng)論。這里值得一提的是一種稱為NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技術(shù)11，它是一種利用電化學(xué)以光的等溫PCR反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中能產(chǎn)生一種與靶RNA反極性的RNA擴(kuò)增子，分子beacon常用于這種技術(shù) ，這種方法常常用于對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量測(cè)定。常用的熱循環(huán)儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量的測(cè)定之所以能成為現(xiàn)實(shí)，并且應(yīng)用如此廣泛，其中一個(gè)重要的原因就是新的熱循環(huán)儀的研制與推廣。目前，國(guó)內(nèi)外常用的熱循環(huán)儀主要有以下幾種：1. PE公司生產(chǎn)的Applied Biosystem系列：(1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一種作為商業(yè)用途的實(shí)時(shí)PCR測(cè)定儀，它由激光激發(fā)熒光，并且可在500-660nm范圍內(nèi)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)，可以用于基于水解探針、雙鏈DNA結(jié)合染料、分子beacon原理的分析。一次可以測(cè)定96個(gè)樣本，并且速度較快，一批樣本的完成只耍要2小時(shí)。但是它不能實(shí)時(shí)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，而只能在全部擴(kuò)增結(jié)束后才進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作與 ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用鹵素?zé)魹榧ぐl(fā)光源，而且只設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)。(3) ABI Prism 7900 SDS: 這是一種為實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)而設(shè)計(jì)的儀器，其基本構(gòu)成與ABI Prism 7700 SDS相同，但程序設(shè)計(jì)完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化要求，而且有兩種樣品盤(pán)可供選擇（96孔和384孔）。如果加上一個(gè)裝載輔件，可以在24h之內(nèi)完成84個(gè)384孔板的樣本測(cè)定。2. Roche 公司生產(chǎn)的Lightcycler熱循環(huán)儀，它以能裝載20-25ul的毛細(xì)硅管作為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，光源選用冷光源系統(tǒng)，可以減少光源對(duì)樣本的影響。由二極管發(fā)射藍(lán)光激發(fā)熒光，并提供三個(gè)濾光片，可利用熒光分光測(cè)定的原理，同時(shí)對(duì)一個(gè)反應(yīng)體系的多種熒光進(jìn)行檢測(cè)，所以它完全可以進(jìn)行多重PCR。由于Lightcycler使用了其獨(dú)特毛細(xì)管反應(yīng)體系和空氣快速熱循環(huán)系統(tǒng)，使樣本能在非常短的時(shí)間內(nèi)有效地實(shí)現(xiàn)溫度變化，從而能在20-30min內(nèi)快速完成30-40循環(huán)，達(dá)到樣本擴(kuò)增的目的12。Lightcycler通常使用的實(shí)驗(yàn)材料主要是SYBRI Green I熒光染料和Taqman熒光探針和雜交探針。雖然Lightcycler有相當(dāng)多的優(yōu)點(diǎn)，但是這也有一些不足之處，由于它只提供一個(gè)32孔的樣品盤(pán)，這使得不能在一次進(jìn)行較多的樣本測(cè)定。3. Bio-rad 公司生產(chǎn)的iCycler iQ：這種儀器提供連續(xù)的檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)，程序滿足實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)處理，可以同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)四種熒光信號(hào)，由于一批能完成96個(gè)樣本的測(cè)定，所以能提供相對(duì)較快的擴(kuò)增反應(yīng)。4. Strategene公司的MX4000 Multiplex: 這種儀器的檢測(cè)波長(zhǎng)可在350-750nm范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以鹵素?zé)糇鳛榧ぐl(fā)光源，常選用的實(shí)驗(yàn)材料包括Taqman探針、雜交探針和分子信標(biāo)（molecular beacon），其樣品盤(pán)的規(guī)格有多處可供選擇，包括96孔盤(pán)、8聯(lián)管或單管，其程序也提供實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。5. Cepheid公司的Smart Cycler System: 這種儀器正如其名一樣具有強(qiáng)大的功能，它有16種反應(yīng)模式可供選擇，而且每種模式都有各自的程序，任一模式不僅能同時(shí)檢測(cè)四種熒光信號(hào)，而且不同的使用者可對(duì)同一批樣品同時(shí)運(yùn)行不同的模式進(jìn)行檢測(cè)。Smart Cycler System的這種設(shè)計(jì)雖然有其優(yōu)點(diǎn)，但是其缺點(diǎn)也是顯而易見(jiàn)的，由于其將樣品盤(pán)分得過(guò)細(xì)，所以不利于同時(shí)進(jìn)行較多樣品的分析。6. Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 這種儀器與Lightcycler相比，屬于中心型熱循環(huán)儀，即從反應(yīng)體系內(nèi)部進(jìn)行熱變化；其具有雙光源系統(tǒng)，藍(lán)光在470nm處激發(fā)熒光，綠光在530nm波長(zhǎng)激發(fā)熒光；具有兩種樣品盤(pán)（32孔和72孔）供選擇；可以對(duì)多種熒光材料進(jìn)行測(cè)定 。熒光材料新進(jìn)展為了滿足實(shí)時(shí)PCR更高敏感性要求，各試劑公司都致力于開(kāi)發(fā)新型的化學(xué)發(fā)光材料，目前作為商業(yè)用途的這些化學(xué)物質(zhì)都能適用于上述的各種儀器。它們主要有以下幾種：1. 水解探針或Taqman探針：這種探針用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的53活性所降解，探針的5端有一熒光報(bào)告基團(tuán)，3端有一熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)相互先靠近的時(shí)候，由于發(fā)生能量傳遞作用，報(bào)告基團(tuán)不能發(fā)出熒光，但隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，5端的報(bào)告基團(tuán)隨著探針的水解而脫落下來(lái)，不再與淬滅發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出熒光，被信號(hào)探測(cè)器所捕獲。常同探針5端相結(jié)合的基團(tuán)有FAM（6羧基熒光素）,TET（四氯6羧基熒光素）,JOE（2，7二甲基4，5二氯6羧基熒光素），HEX（六氯6甲基熒光素）或VIC，常與3端相結(jié)合的熒光淬滅基團(tuán)常為T(mén)AMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4-惡烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相較之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的減少自發(fā)熒光信號(hào)6。目前，水解探針已被用于基因檢測(cè)13、病毒定量14,15、癌細(xì)胞基因微突變檢測(cè)16、細(xì)胞因子基因定量17等，其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性。2. 分子信標(biāo): 是一種單鏈DNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其一端有一報(bào)告基團(tuán)，在另一端有一淬滅基團(tuán)18，當(dāng)它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，由于熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)想互靠近，兩者之間發(fā)生熒光信號(hào)能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescent resonance energy transfer FRET），當(dāng)熱循環(huán)溫度達(dá)到分子beacon的解鏈溫度時(shí)，其構(gòu)象發(fā)生改變，能與模板結(jié)合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)19,20。分子信標(biāo)特別適用于檢測(cè)點(diǎn)突變，這能區(qū)分只有一個(gè)核苷酸差異的不同DNA序列，而且其敏感性要遠(yuǎn)比同等長(zhǎng)度的寡核苷酸探針高21,22，分子beacon已被用于突變檢測(cè)23,24、病原體定量25,26、病毒檢測(cè)27和胚胎的性別判斷28，它同時(shí)出用于多重PCR檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒29。3. scorpions: 它由兩個(gè)寡核苷酸分子組成，一個(gè)是引物，另一個(gè)是帶熒光分子的探針，但是此探針也具有引物的功能30。引物與形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針相連，在探針上由于熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互靠近，不能發(fā)射熒光。在反應(yīng)的變性階段，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)解開(kāi)，構(gòu)象發(fā)生改變，在退火時(shí)則與模板相結(jié)合，形成線性分子，報(bào)告基團(tuán)同淬滅基團(tuán)分離而發(fā)射熒光。同Taqman探針和分子beacon相比，scorpion能更快地發(fā)射出熒光且信號(hào)更為強(qiáng)烈31，其特異性也很高，因?yàn)橹挥性诜磻?yīng)體系中存在特異的目的基因，探針-引物才會(huì)與之相結(jié)合。Scorpion是一種較新的熒光材料，具有良好的應(yīng)用前景31。4. 雜交探針：該材料使用四個(gè)寡聚核苷酸分子，兩個(gè)引物與兩個(gè)探針，雜交探針?lè)謩e單標(biāo)，一個(gè)攜帶熒光供體基團(tuán)，一個(gè)攜帶熒光受體基團(tuán)，當(dāng)這兩個(gè)探針雜交到目的基因上時(shí)，能形成首尾相連的結(jié)構(gòu)使兩個(gè)熒光基團(tuán)相互靠近，發(fā)生FRET。受體基團(tuán)能轉(zhuǎn)移能量，使得供體基團(tuán)在不同波長(zhǎng)條件下被激發(fā)，發(fā)射出的熒光量直接與目的基因的產(chǎn)量成相關(guān)關(guān)系32。這一方法已被Roche公司生產(chǎn)的Lightcycler所應(yīng)用，進(jìn)行病原體檢測(cè)33、病毒荷載量34的測(cè)定等領(lǐng)域。5. SYBR Green I: 這是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光35。它的最大優(yōu)點(diǎn)就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，它也比其它的探針的價(jià)格要便宜得多，但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，那它就會(huì)影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性36。要避免這種不利因素，一方面可以通過(guò)Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等熱循環(huán)儀內(nèi)設(shè)定的程序過(guò)對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，以區(qū)分由PCR產(chǎn)物和本底造成的熒光信號(hào)，另一方面就是選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響37。實(shí)踐中的問(wèn)題：實(shí)時(shí)定量PCR已廣泛地運(yùn)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，就目前的應(yīng)用情況來(lái)看，雖然取得了很好的效果，但是其在方法學(xué)上的選擇、敏感性問(wèn)題、重復(fù)性問(wèn)題等都一直是爭(zhēng)論不休的，本文將就這些問(wèn)題做出探討。1. 方法的選擇：研究者在實(shí)驗(yàn)中往往想要得到目的基因的絕對(duì)量，因?yàn)榻^對(duì)定量對(duì)目的基因的表達(dá)差異有直接的反映38。絕對(duì)定量最為簡(jiǎn)單的方法就是標(biāo)準(zhǔn)曲線法，用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同等條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒dsDNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA39。目的基因與標(biāo)準(zhǔn)品在不同的反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，使用的熒光材料可以是雜交探針、水解探針或是SYBR Green I。有研究表明40，這一方法的動(dòng)力學(xué)范圍可以達(dá)到9個(gè)數(shù)量級(jí)，遠(yuǎn)比終點(diǎn)法的要高。這一方法雖然簡(jiǎn)便，但是為了得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有兩個(gè)先決條件必須等到滿足，一是所選用的標(biāo)準(zhǔn)品必須與目的基因的擴(kuò)增效率一致，要達(dá)到這個(gè)要求，需要標(biāo)準(zhǔn)品同目的基因的同源性盡可能的高，不僅長(zhǎng)度相似，而且其堿基組成也盡量相同；二是要盡可能地優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和模板的準(zhǔn)備過(guò)程。就標(biāo)準(zhǔn)品而言，實(shí)踐中有外參照和內(nèi)參照之分，作為外參照的標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因不在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所以它無(wú)法檢測(cè)也不可能補(bǔ)償可能出現(xiàn)在目的基因反應(yīng)體系中的影響因素，如PCR抑制子41。事實(shí)上，在絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，要想使標(biāo)準(zhǔn)品和目的基因的擴(kuò)增效率完全一致是不可能的。為了彌補(bǔ)單獨(dú)使用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為外參照的不足，研究者便引入一個(gè)內(nèi)參照同目的基因在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，以反映體系中可能出現(xiàn)的PCR影響因素，此即所謂的競(jìng)爭(zhēng)性PCR。競(jìng)爭(zhēng)性PCR 所使用的內(nèi)參照具有與目的基因序列相同的引物結(jié)合位點(diǎn)，但不具有相同的探針結(jié)合位點(diǎn)42。關(guān)于內(nèi)參照的設(shè)計(jì)，有多種方法可供選擇，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突變43，改變目的基因中的某些核苷酸44，設(shè)計(jì)不同的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)45，也可以用非特異的間隔基因或間隔DNA 作為內(nèi)參照46。競(jìng)爭(zhēng)性PCR 設(shè)計(jì)的原理在于內(nèi)參照與目的基因相互競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的原料，所以兩者的量應(yīng)當(dāng)相互匹配，如果一方的拷貝數(shù)大大的高于另一方，那么拷貝數(shù)多的一方就會(huì)在反應(yīng)體系中得到優(yōu)先擴(kuò)增，而拷貝數(shù)少的一方則擴(kuò)增受到抑制，定量也就不能有效地進(jìn)行。由于使用了內(nèi)對(duì)照，所以一旦體系中存在干擾PCR擴(kuò)增的因素，就會(huì)通過(guò)內(nèi)對(duì)照的擴(kuò)增效率的變化反映出來(lái)，目前使用的實(shí)時(shí)定量PCR儀都是以擴(kuò)增曲線上crossing point的漂移來(lái)體現(xiàn)擴(kuò)增效率的變化的。競(jìng)爭(zhēng)性PCR 由于能夠消除反應(yīng)體系中干擾因素的影響，所以它所等到的結(jié)果要準(zhǔn)確可靠得多，但是由于在反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩種模板，使得其結(jié)果的測(cè)定范圍比單使用外參要大為縮小，往往只有2-3個(gè)數(shù)量級(jí)40。正是由于競(jìng)爭(zhēng)性PCR 有利有辟，所以研究者應(yīng)根據(jù)不同的情況決定是否使用內(nèi)參照。在目前的研究中，大多數(shù)研究者選擇使用絕對(duì)定量的方法，但是也有學(xué)者47認(rèn)為在當(dāng)前的條件下，絕對(duì)定量具有難以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也有相當(dāng)多的問(wèn)題，目前廣泛使用的在260nm波長(zhǎng)下定量的方法與眾多因素有關(guān)，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過(guò)程都會(huì)影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。（2）標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質(zhì)易于被降解，而每次配制新的標(biāo)準(zhǔn)品又會(huì)增加批間差異。（3）每次測(cè)定樣本都要同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內(nèi)測(cè)定更多的樣本，這樣也就使實(shí)時(shí)PCR 的高通量有所降低。（4）由于樣本來(lái)源存在極大的差異，所以很難保證標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因的擴(kuò)增效率一致。這樣會(huì)大大增加結(jié)果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會(huì)對(duì)定量的結(jié)果造成很大的差異。鑒于以上原因，這些學(xué)者強(qiáng)烈地推薦使用相對(duì)定量的方法，所謂相對(duì)定量是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因，該管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較；（2）作為內(nèi)源性對(duì)照補(bǔ)償待測(cè)樣本的體積變異、核酸抽提過(guò)程中造成的目的基因變異，以及反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素；（3）標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)本47。由于管家基因在各種組織中是恒定表達(dá)的，所以可以以管家基因的定量來(lái)作為某種標(biāo)準(zhǔn)以比較樣本來(lái)源不同的目的基因表達(dá)量的差異。通常選用的管家基因有GAPDH 、-actin、2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根據(jù)具體的需要而選定合適的管家基因。使用的相對(duì)定量較為早期的方法是用一系列已知外參物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得到目的基因和管家基因的量，再將目的基因的同管家基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這一方法要求外參、目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率一致。除了這種常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen48設(shè)計(jì)了一種比較閾值法來(lái)測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)，他們根據(jù)數(shù)學(xué)推導(dǎo)得出目的基因的量=2-Ct，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測(cè)到反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度值，Ct=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)對(duì)照，所以，2-Ct表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可以直接得到的目的基因相對(duì)于管家基因的定量，而不必制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以這一方法更為簡(jiǎn)便省時(shí)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明這一方法的結(jié)果也是相當(dāng)可靠的。總之，相對(duì)定量不僅比絕對(duì)定量更加簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)（如果不做標(biāo)準(zhǔn)曲線），而且也更為可靠和準(zhǔn)確，因?yàn)榇嬖谟诜磻?yīng)體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑影響等都可以通過(guò)數(shù)學(xué)處理而去除。2. 重復(fù)性問(wèn)題：重復(fù)性是判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)劣的重要指標(biāo)，其主要判斷指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。對(duì)于特定的分析系統(tǒng)，重復(fù)性的高低決定了PCR反應(yīng)能檢測(cè)出樣本中目的基因的初始濃度變化的最小值。由于PCR反應(yīng)本身具有不精確擴(kuò)增的特性，它所造成的結(jié)果精確性要遠(yuǎn)小于經(jīng)典的臨床化學(xué)檢驗(yàn)和免疫分析。對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，一般都可以計(jì)算出所設(shè)計(jì)體系能檢測(cè)出樣本初始濃度的最小值，根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)可以求得該最小值的變異情況和它的可信區(qū)間范圍，變異越小或是可信區(qū)間范圍越小，說(shuō)明這一反應(yīng)體系的精確度越高。在實(shí)時(shí)定量PCR過(guò)程中，從樣本的準(zhǔn)備到擴(kuò)增，再到定量的進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)方面都與實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性息息相關(guān)，除了加樣的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)所選用的儀器固定參數(shù)的限制之外，影響結(jié)果重復(fù)性較為關(guān)鍵的因素還包括（1）PCR 反應(yīng)擴(kuò)增的效率，如果在反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不一致，就會(huì)影響到目的基因在單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量發(fā)生差異，從而影響到結(jié)果的穩(wěn)定，要解決這個(gè)問(wèn)題，必須盡量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到最佳擴(kuò)增效率。（2）目的基因的初始濃度，初始拷貝數(shù)越低，結(jié)果的重復(fù)性越差，為了保證獲得精確的結(jié)果，應(yīng)使用初始濃度具有較高數(shù)量級(jí)的樣本，如果待測(cè)樣本中目的基因的量處于反應(yīng)體系的檢出限附近，那么最好是使用復(fù)孔以保證結(jié)果的可靠性。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，對(duì)于必須進(jìn)行絕對(duì)定量的研究，標(biāo)準(zhǔn)曲線是必不可少的，雖然標(biāo)準(zhǔn)品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個(gè)好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)定量結(jié)果至關(guān)重要，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)至少選擇5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測(cè)樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過(guò)程中，應(yīng)使用規(guī)范的步驟或是根據(jù)所購(gòu)買(mǎi)的試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行。3. 敏感度問(wèn)題：實(shí)時(shí)定量PCR 由于使用了熒光物質(zhì)作為定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人47報(bào)導(dǎo)實(shí)時(shí)定量PCR 的敏感性要高出傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量PCR 大約250倍。在理論上，只要設(shè)計(jì)的引物對(duì)目的基因有足夠的特異性，PCR 應(yīng)可檢測(cè)出只含一個(gè)拷貝目的基因的樣本，也的確有人報(bào)導(dǎo)在特定的反應(yīng)條件下，實(shí)時(shí)定量PCR 可以檢測(cè)出單細(xì)胞水平的基因組DNA11，但是在大多數(shù)情況下，對(duì)基因組DNA而言，它的最低檢出限一般在pg到fg級(jí)，對(duì)于病毒、質(zhì)粒而言，其檢出限一般在102-103拷貝數(shù)以上8。影響實(shí)時(shí)定量PCR 敏感性的因素眾多，除了對(duì)一般PCR反應(yīng)均存在的影響因素如反應(yīng)體系、Taq酶的活性之外,實(shí)時(shí)定量PCR還有其特殊的影響因素，包括：(1)反應(yīng)體系中形成的引物二聚體的影響：引物二聚體是非特異性退火和延伸的產(chǎn)物,它的形成不僅會(huì)影響到擴(kuò)增的效率,而且由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以會(huì)在反應(yīng)體系中出現(xiàn)特異性產(chǎn)物與引物二聚體競(jìng)爭(zhēng)SYBR Green I的現(xiàn)象,從而降低了實(shí)時(shí)PCR的敏感性。要解決這個(gè)問(wèn)題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的形成，但是在定量檢測(cè)時(shí)，它卻可以避開(kāi)引物二聚體的干擾，專(zhuān)一地測(cè)定來(lái)自于特異產(chǎn)物的熒光信號(hào)，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)使用水解探針的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用熱啟動(dòng)辦法，所謂熱啟動(dòng)是指在反應(yīng)體系達(dá)到引物退火溫度時(shí)才加入某一反應(yīng)成分，因?yàn)橐锒垠w的是在各種試劑一經(jīng)混合便開(kāi)始形成的，所以用這種方法能有效地減少引物二聚體的形成，另外Lightcycler提供一種Taq酶的抗體，在PCR反應(yīng)的最初階段，這種抗體能阻斷Taq酶的作用，但是當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到70度時(shí)，它便失活，使Taq酶開(kāi)始發(fā)揮作用，在反應(yīng)體系中加入這一抗體的目的也就是使要在反應(yīng)達(dá)到較高溫度時(shí)，才開(kāi)始PCR擴(kuò)增，從而避免反應(yīng)初始階段引物二聚體的形成。第三，要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，例如所設(shè)計(jì)的兩條引物不能互補(bǔ)（尤其在3端），使兩條引物的GC含量大致一致，使用純化的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)等，這些都是防止引物二聚體形成的根本因素。第四，如果反應(yīng)體系中出現(xiàn)PCR的抑制因素，應(yīng)適當(dāng)將目的基因的濃度稀釋后再進(jìn)行擴(kuò)增。最后，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)注意避免室溫混合各種試劑，并且在一經(jīng)混合后立即開(kāi)始進(jìn)行擴(kuò)增。（2）循環(huán)數(shù)：一般的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)只須2530個(gè)循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果，但是對(duì)于那些極微量的待測(cè)樣本而言，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)可以提高反應(yīng)的檢出限，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)當(dāng)循環(huán)數(shù)從25增加到34個(gè)循環(huán)時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多，其敏感性就會(huì)越高，實(shí)際上，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí)，敏感性便不再升高，因?yàn)檠h(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，也不可能因?yàn)樵黾用舾行远鵁o(wú)限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實(shí)踐中行不通，而且在理論上也不可行，因?yàn)殡S著循環(huán)數(shù)的增加，一方面，聚積的產(chǎn)物會(huì)抑制Taq酶的活性，另一方面，也會(huì)增加形成異源二聚體的可能性，這些都會(huì)影響到最終的定量結(jié)果。（3）Mg2的濃度：根據(jù)Roche公司的Lightcycler3.5版本技術(shù)說(shuō)明，Mg2+的濃度將影響到實(shí)時(shí)定量PCR的敏感性，其推薦使用的濃度為3mM。Mg2+濃度對(duì)敏感性的影響主要存在于兩方面，首先，Mg2+是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，如果Mg2+的濃度無(wú)法達(dá)到使Taq酶發(fā)揮最佳活性，無(wú)疑將會(huì)影響到實(shí)時(shí)定量的敏感性；其次，Mg2+的濃度過(guò)高，會(huì)增加引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致敏感性降低。所以在反應(yīng)中選擇合適的Mg2+濃度條件，是相當(dāng)重要的。實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化：由于各家公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀提供的各種實(shí)驗(yàn)方案不太一致，所以優(yōu)化的策略也不盡相同，然而在各種方案中，前文所述的那些影響實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)的因素卻總是相通的。只要能較好地控制實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，要想獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一定都是困難的。下面本文將就影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一些基本參數(shù)和實(shí)驗(yàn)步驟談一談關(guān)于實(shí)時(shí)定量PCR的優(yōu)化。1. 基本參數(shù)的優(yōu)化：1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應(yīng)中，MgCl2的濃度對(duì)影響酶的活性是至關(guān)重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。所以對(duì)其的深度選擇應(yīng)慎重。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇25mM濃度的MgCl2，對(duì)以mRNA為模板的RTPCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為48mM。1.2 模板的濃度：如果研究者是進(jìn)行首次實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個(gè)稀釋度（高和中、低濃度）來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般而言，使Cp位于1530個(gè)循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對(duì)于Cp值的確定，經(jīng)驗(yàn)上是SYBR Green I探針的熒光信號(hào)比本底高2倍，雜交探針的熒光強(qiáng)度比本底高0.3倍。 2. 使用SYBR Green I測(cè)定DNA時(shí)的條件優(yōu)化：2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物模板對(duì)其的要求是24 mM。2.2模板的濃度：初次實(shí)驗(yàn)要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個(gè)稀釋的度的測(cè)定?；蚪MDNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右選擇。2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進(jìn)行稀釋?zhuān)窃谀承l件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達(dá)到好的效果，反會(huì)使反應(yīng)的敏感度降低，所以，研究者若要進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR研究，最好選用純化的模板。2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個(gè)影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其濃度太低，會(huì)致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯(cuò)配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會(huì)大大增加。對(duì)于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.5uM是個(gè)合適的濃度，若初次選用這個(gè)濃度不理想，可在0.31.0uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。2.6 退火溫度：首次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計(jì)算得出的Tm值小5，然后在12內(nèi)進(jìn)行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，這個(gè)經(jīng)驗(yàn)值往往會(huì)同計(jì)算得到的Tm值有較大的差距。3. 用SYBR Green I進(jìn)行一步法RTPCR的條件優(yōu)化：3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在48mM之間選擇。3.2模板的濃度：RTPCR實(shí)驗(yàn)既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應(yīng)在1pg-1ug之間選擇。對(duì)于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進(jìn)行測(cè)定。3.3對(duì)照設(shè)置：每一引物都應(yīng)設(shè)有陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和污染對(duì)照。4. 雜交探針測(cè)定DNA4.1 MgCl2的濃度：在24mM的基礎(chǔ)上加0.51.0mM，但是不要超過(guò)2.0mM。4.2雜交探針的濃度：初次實(shí)驗(yàn)每個(gè)探針用0.2uM，如果信號(hào)強(qiáng)度達(dá)不到要求，可以增加至0.4uM。4.3對(duì)照設(shè)置：每一引物都要設(shè)陰性對(duì)照，每一探針都要設(shè)陰性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。4.4 其它的條件同SYBR Green I。5 用雜交探針實(shí)時(shí)定量RTPCR：5.1 MgCl2的濃度：在48mM之間進(jìn)行選擇。5.2雜交探針的濃度：初實(shí)驗(yàn)用0.2 uM，如果熒光信號(hào)強(qiáng)度不足，可以增加至0.4uM。5.3模板濃度設(shè)置：優(yōu)化的擴(kuò)增須進(jìn)行一系列知釋度的實(shí)驗(yàn)，在條件有困難的條件下，至少要進(jìn)行兩個(gè)稀釋度的測(cè)定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過(guò)?。ㄐ∮?0ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。5.4 對(duì)照設(shè)置：每個(gè)引物都要設(shè)無(wú)模板對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以及污染對(duì)照。6.關(guān)于雜交探針的評(píng)價(jià)：在使用雜交探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須注意防止探針引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過(guò)程中的延伸。引物探針二聚體的形成，主要是因?yàn)樘结樋膳c引物的3末端雜交，其形成以后，會(huì)致使此二聚體擴(kuò)增，從而同目的基因競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的原料，致反應(yīng)的效率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒(méi)有磷酸化，就會(huì)產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鑒于以上這兩點(diǎn)，所以應(yīng)對(duì)探針精心設(shè)計(jì)，并將其末端完全磷酸化。目前的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)展迅速，本文是結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的工作經(jīng)驗(yàn)以及文獻(xiàn)資料寫(xiě)成的，文中提到的一系列方案、實(shí)驗(yàn)材料和儀器設(shè)備都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，也有各自的使用范圍，不能一概而論。所以不論研究者想進(jìn)行何種研究，都應(yīng)根據(jù)自己的情況首先找到適合自己研究目的的條件，本文僅供有意于運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行研究的人員參考。參考文獻(xiàn)：1. 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