克隆及誘導蛋白步驟.docx

1植物 RNA提取使用天根植物RNA快速提取試劑盒提取棉花RNA，詳細步驟見說明書。核酸分析儀分析RNA濃度1.打開軟件ND-1000V3.5.1，選擇“Nucleic acid”；2.擦拭加樣處，用DEPC水清洗（1l）之后點擊“OK”;3.選擇“RNA”，擦拭，再加1l DEPC水作空白，點擊“Blank”；4.擦拭進樣口，吸1l RNA樣品，點擊“M easure”,記錄結果；5.擦拭，吸取1l DEPC水清洗進樣孔，點擊“Blank”，再次進樣，重復步驟4.6.記錄結果:A260/A280; A260/A230; ng/lA260是核酸最高吸收峰的吸收波長A280是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長A230是碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑的吸收波長A260/A280的比值在1.62.0之間，表明沒有蛋白質污染A260/A230的比值在2.02.4之間，表明沒有鹽類小分子污染剩余RNA放-80冰箱保存或繼續(xù)進行試驗2基因克隆根據(jù)轉錄組及基因組注釋的目的基因ORF序列，合并同源基因，設計了引物，以期獲得全部家族基因。處理的棉花葉片提取RNA，反轉錄 天根快速反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA 無RNase離心管 1.各試劑使用前混勻并短暫離心；2. gDNA去除體系，混勻，短暫離心，置于42 3min 后置于冰上。 TotalRNA 約1500ng 5Buffer 3l RNaseFreeddH2O 補足到15l3.反轉錄反應體系10FastRT Buffer 3lRTEnyme Mix 4lFQ-RT primer Mix 2lRNase -Free 7.5lTotal 15l4.取3混合液加到2步溶液中，混勻，并輕微離心；5.42孵育15min，95孵育3min 放到冰上。得到cDNA用于后續(xù)試驗。-20保存。PCR檢測模板 Taqmix 10l ACT-jianceF 0.4lACT-jianceR 0.4lT 1lddH2O 8.2l Total 20lPCR程序94 4min94 30s55 30s 38cycles72 30s10 做膠，跑膠若條帶在400-500bp之間，說明模板可用克隆，P基因或做熒光定量檢測目的基因表達上調或下調。（實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。檢測方法1.SYBRGreen法:在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖PCR產(chǎn)物熔解曲線圖(單一峰圖表明PCR擴增產(chǎn)物的單一性2.TaqMan探針法:探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。）做蛋白功能接下一步Pfu高保真酶5XHFBuffer 5ldNTP 2.5lPfu 0.5 FP 0.5lRP 0.5lT 3lddH2O 13lTotal 25lPCR程序94 4min94 30s 30s 35cycles72 s10 電泳，若條帶符合序列長度，則進行膠回收。膠回收1.在紫外燈下切含目的的基因膠；2.加500l Buffer DE-A混合后75 68min至膠熔化；3.加250l Buffer DE-B混合(目的片段400bp，加1體積異丙醇)變黃色，準備DNA制備管，置于2ml離心管中；4.吸取3中混合液于DNA制備管中，離心12000r/min，30s，棄濾液；5.制備管重置2ml離心管，加500l Buffer W1(除去蛋白質)，離心12000r/min，30s，棄濾液；6. 加700l Buffer W2(除去離子、鹽)，離心12000r/min，30s，棄濾液，棄廢液后以同樣的方法再用Buffer W2(除去離子、鹽)洗滌一次，離心12000r/min，1min，棄濾液；(確定在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇，兩次沖洗，使用Buffer W2能確保鹽分被完全消除，消除對酶切反應的影響)7.將制備管置回2ml離心管中，離心12000r/min，空離1min;8. 將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備膜中加入20l去離子水ddH2O,室溫靜置1min，離心12000r/min，1min,洗脫DNA。（將去離子水加熱至65，提高洗脫效率）連接PEASY- T3(Blunt)連接 快連吹打、離心4l DNA1l T3載體 室溫連接30min,20min時拿感受態(tài)細胞（每支100l，分兩管使用）轉化1.將trans 1-T1 感受態(tài)細胞從-80冰箱中取出，置于冰上10min;2.輕輕吸已連載體，打入50l感受態(tài)細胞中；3.冰上靜置30min；4.42熱激45s，勿動；5.冰上靜置5min/2min；6.在超凈臺上向已經(jīng)完成轉化的離心管中加入500lALB液體培養(yǎng)基；7.37 200 rpm 1h 涂板1.取出已倒好的板（燒好玻璃棒，涼30min）；2.取10lAmp、40lX-gal、40l IPTG 在1.5ml離心管中混勻；3.分別取90l于板上，涂勻；4.取400l已搖好的菌涂板；5.先正置培養(yǎng)30min,再倒置培養(yǎng)12-16h；6.4保存，以備后續(xù)試驗LB培養(yǎng)基1L 1L 400mL蛋白胨（Tryptone） 10g 4g酵母提取物（Yeast extract） 5g 2gNaCl 10g 4g瓊脂粉（Agar powder,固體） 15g(1.3-1.5%) 6g蒸餾水定容至1L/400mL。挑斑：加入200l Amp+ LB于離心管中，用2.5l槍槍頭挑斑，一個槍頭一個斑，打入離心管中，每個板挑12個菌，搖菌12h。（挑白斑中等大小，相對在培養(yǎng)皿中部，與藍斑相近的斑，點的每個斑之間的距離不要太近）菌液PCRTaqmix 10lM13F 0.4l M13R 0.4lT 1lddH2O 8.2lTotal 20lPCR程序94 6min(環(huán)狀需要的時間長一些)94 30s55 30s 38cycles72 2 min10 PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠回收PCR產(chǎn)物, 轉化全式金公司Trans1-T1克隆感受態(tài)細胞, 經(jīng)菌液PCR檢測后送公司測序。序列正確后以備后續(xù)工作。3原核表達根據(jù)目的基因的ORF序列設計雙酶切引物構建目的基因-pET30a融合表達載體。GhTPS-pET30a融合表達載體構建的具體步驟如下:(1) 根據(jù)GhPS的ORF序列 (去信號肽) 設計雙酶切引物GhPS-F和GhPS-R, (2) PCR擴增后, 將擴增產(chǎn)物及pET-30a分別用引物序列中所示內切酶進行酶切:10M Buffer2 L10M Buffer2 L內切酶11 L內切酶11 L內切酶21 L內切酶21 LGhTPS PCR產(chǎn)物10 LpET-30a10 LddH2O6 LddH2O6 LTotal volume20 LTotal volume20 L金屬浴中37C消化2 h后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測; (3) 使用AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit回收目的產(chǎn)物; (4) 將回收的目的片段連接至pET-30a片段:2T4 ligase Buffer5 LT4 DNA Ligase1 LpET-30a雙酶切片段1 LGhTPS雙酶切片段3 LTotal volume10 L慢連 金屬浴中16C連接過夜; (5) 將連接產(chǎn)物轉化到全式金公司Trans1-T1克隆感受態(tài)細胞中, 菌液PCR檢測后, 挑選陽性克隆送公司測序; (6) 測序正確的菌液提取質粒, 轉化到博邁德公司表達細胞Rosetta (DE3) 中, 菌液PCR檢測和測序后, 在測序正確的菌液中加入甘油, 保存菌種于-20C或直接用于融合蛋白的誘導表達。3使用IPTG誘導融合蛋白的表達, 具體步驟如下:(1) 小量表達蛋白以確定最佳誘導IPTG濃度:吸5 L保存的菌種加入到5 mL Kan抗性的液體LB, 恒溫搖床中37C, 220 rpm過夜培養(yǎng)。第二天按1:100比例將菌液加入到5 mL新的Kan抗性液體LB中, 在恒溫搖床中37C, 220 rpm培養(yǎng)2-3 h。當細胞達到對數(shù)生長期, 加入不同濃度的IPTG誘導蛋白表達, 37C, 150 rpm振蕩培養(yǎng)5-8 h。(2) 大量表達蛋白:吸5 L保存的菌種加入5 mL Kan抗性的液體中, 在恒溫搖床中37C, 220 rpm過夜培養(yǎng)。第二天按1:100的比例將菌液加入到400 mL新的Kan抗性液體LB, 在恒溫搖床中37C, 220 rpm培養(yǎng)2-3 h。當細胞達到對數(shù)生長期,按1:1000的比例加入400 L IPTG, 18C, 150 rpm繼續(xù)培養(yǎng)20 h。然后，10000 rpm, 4C離心10 min, 倒掉上清, 用4mL 抽提緩沖液extraction buffer (50 mM Mopso, pH 7.0, 5 mM MgCl2, 5 mM sodium ascorbate, 0.5 mM PMSF, 5 mM dithiothreitol和10% v/v glycerol) 吹打懸浮菌體。超聲波進行破碎, 5 s破碎一次, 破碎5 min, 然后16000 rpm, 4C離心20 min, 分別收集上清和包涵體。5酶活性鑒定分別以NPP、GPP、FPP和GGPP為底物, Agilent 2 ml的螺紋蓋進樣瓶中加入下列反應體系:Mops (pH 7.0, 200 mM)100 Ldithiothreitol (1 M)2 Lglycerol (100% v/v)200 LMgCl2 (100 mM)200 LMnCl2 (100 mM)1 LNaWO4 (100 mM)4 LNaF (500 mM)0.4 LNPP/GPP/FPP/GGPP30/3.7/4.3/4.5 LH2O216.3/242.6/242.0/241.8 L純化的蛋白溶液500 LTotal volume1 mL加入500 L正己烷收集酶活產(chǎn)物, 用封口膜密封進樣瓶。恒溫水浴鍋30C水浴1 h。渦旋并離心, 吸200 L上清，使用0.22 m有機濾膜過濾, 轉移至新的進樣瓶, 封口膜密封, 放入-20C冰箱保存或直接吸取1 L進行GC-MS定性與定量檢測。6 GC-MS分析方法使用島津單四極桿氣質聯(lián)用儀 (GCMS-QP2010 SE) 進行揮發(fā)物定性定量分析。毛細管柱為Rxi-5Sil MS (30 m0.25 mm0.25 m, RESTEK, USA)。載氣為He, 進樣口溫度為250C, 不分流, 進樣口流速和柱流速分別為10 mL/min和1 mL/min。進樣量1 L, 程