基質(zhì)固相分散–反相液相色譜測(cè)定蔬菜中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留.doc

基質(zhì)固相分散反相液相色譜測(cè)定蔬菜中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留孫福生* 董杰 （蘇州科技學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蘇州，215011）摘要：應(yīng)用基質(zhì)固相分散反相液相色譜技術(shù)建立了提取、檢測(cè)蔬菜中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留的分析方法。研究了不同的提取條件(萃取吸附劑、樣品與吸附劑的比例、洗脫劑和用量等)及測(cè)定條件對(duì)檢測(cè)二甲戊樂(lè)靈的影響，確定了最佳提取條件：萃取吸附劑是弗羅里硅土、樣品與弗羅里硅土吸附劑的比例為1：4、20mL乙酸乙酯洗脫劑。二甲戊樂(lè)靈的測(cè)定線性范圍為0.02-2.0mg/L、 r0.999。應(yīng)用此方法測(cè)定了某些蔬菜樣品中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留，測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2-5.2。在幾種蔬菜中的加標(biāo)回收率為84.5-92.5，方法檢出限在11-20mg/kg范圍內(nèi)。關(guān)鍵詞：基質(zhì)固相分散；二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留；反相液相色譜；蔬菜二甲戊樂(lè)靈是二硝基苯胺類選擇性土壤處理除草劑, 是當(dāng)前除草劑中殺草譜很廣的除草劑之一，用于防除一年生禾本科雜草和某些闊葉雜草,除草效果好,安全性高,現(xiàn)已國(guó)產(chǎn)化并得到廣泛應(yīng)用。土壤對(duì)其吸附性強(qiáng)，不易淋溶，在土壤中移動(dòng)性小。其農(nóng)藥殘留對(duì)后茬作物會(huì)產(chǎn)生藥害。二甲戊樂(lè)靈被認(rèn)為是可疑的內(nèi)分泌干擾劑和可能的致癌物質(zhì)1。歐洲已有國(guó)家(組織)禁用或限用此農(nóng)藥,美國(guó)已對(duì)大豆中二甲戊樂(lè)靈殘留量提出了嚴(yán)格的限制指標(biāo)（0.1mg/kg）2。我國(guó)規(guī)定二甲戊樂(lè)靈在葉菜中的最高殘留限量為0.2mg/kg，日本為0.2mg/kg （結(jié)球甘藍(lán)）、韓國(guó)也為0.2mg/kg （包心菜）3。測(cè)定二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留所使用的儀器方法主要有氣相色譜（GC）4-5、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）6-7、液相色譜(LC)8、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)7等法。在已報(bào)道的蔬菜中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留的測(cè)定中，大多采用傳統(tǒng)的液-液萃取(LLE)法提取樣品中目標(biāo)物，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮富集，如需要再經(jīng)凈化后進(jìn)行測(cè)定3，5，9。這種方法需消耗大量有毒有害的有機(jī)溶劑,繁瑣費(fèi)時(shí),而且在萃取過(guò)程中容易產(chǎn)生大量乳狀液,影響萃取效率。自1989年美國(guó)Louisiana州立大學(xué)Barker教授首次提出基質(zhì)固相分散（MSPD）技術(shù)10 后，已在蔬菜、水果等農(nóng)藥殘留檢測(cè)中得到一定的應(yīng)用。這是一種嶄新的固相萃取(SPE)新技術(shù)，其基本操作是將試樣直接與弗羅里硅土和反相填料（如C18、C8等）研磨、混勻成半固態(tài)后裝柱洗脫。MSPD簡(jiǎn)化了這類樣品的傳統(tǒng)處理中所需的樣品均化、組織細(xì)胞破裂、提取、凈化等過(guò)程，避免了樣品均化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮等造成的目標(biāo)檢測(cè)物的損失。應(yīng)用MSPD樣品處理并分析蔬菜中二甲戊樂(lè)靈殘留鮮有報(bào)道，而張智超等報(bào)道了以涂敷AgNO3 的堿性氧化鋁為分散劑的MSPD法提取、氣相色譜/電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)大蒜中痕量二甲戊樂(lè)靈殘留的分析方法1。本研究采用MSPD技術(shù)，將蔬菜樣品直接與弗羅里硅土研磨，優(yōu)化了MSPD各種條件，并用反相液相色譜（RPLC）測(cè)定提取液中的二甲戊樂(lè)靈，其結(jié)果令人滿意。1 實(shí)驗(yàn)部分_基金項(xiàng)目：江蘇省環(huán)境工程重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（A0030803）作者簡(jiǎn)介：孫福生（1945- ），男，教授1.1 儀器與試劑用Agilent 1100液相色譜儀（美國(guó)加利福尼亞安捷倫技術(shù)公司）分離檢測(cè)二甲戊樂(lè)靈，它由一個(gè)四元泵、真空脫氣器、恒溫柱箱和可變波長(zhǎng)檢測(cè)器組成。使用Rheodyne型號(hào)7125手動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)加利福尼亞Rheodyne公司）和20微升定量管進(jìn)樣。色譜柱是Hypersil柱（2004.6 mm i.d.，5m ODS C18微粒，美國(guó)安捷倫公司）。用甲醇溶解二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)品（99，江蘇龍燈化學(xué)有限公司）并定容配置成10000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)系列溶液是用甲醇逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液而得。甲醇、乙腈（色譜純，Merck，Germany）；乙酸乙酯（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑）、正己烷、二氯甲烷、甲苯（分析純，上海化學(xué)試劑有限公司），使用前重蒸并過(guò)0.45m濾膜。弗羅里硅土（Florisil分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，100-200目，130C活化4-6小時(shí)；無(wú)水硫酸鈉（分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司，于馬弗爐450C活化4小時(shí)；C18填料（40-63mm，60，SILICYCLE），使用前先進(jìn)行活化處理，方法如下：在50mL玻璃注射器內(nèi)裝入2.0 gCl8，分別用2倍柱體積的正己烷、二氯甲烷和甲醇依次洗滌，真空干燥，貯于試劑瓶?jī)?nèi)備用。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（Milipore，USA）。1.2 色譜條件7采用Agilent 1100可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器對(duì)100 mg/L二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm。對(duì)10 mg/L二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，確定最佳色譜條件：流動(dòng)相為100%甲醇，流速0.8mL/min，柱溫25C。在該條件下，圖1為10 mg/L二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，二甲戊樂(lè)靈的保留時(shí)間為2.994min。圖 1 二甲戊樂(lè)靈色譜圖 Fig.1 Chromatogram of pendimethalin1.3 MSPD操作步驟取蔬菜樣品若干，用榨汁機(jī)打成均勻漿狀，準(zhǔn)確稱取0.5g勻漿于玻璃研缽中，加入2.0g已活化的弗羅里硅土作為分散劑，充分研磨至樣品顆粒完全分散在弗羅里硅土中，待裝柱。取10mL注射器，底部填入少量脫脂棉后再放一濾紙片，加入2.0g無(wú)水硫酸鈉，然后將上述研缽中的混合物均勻地倒入注射器裝柱，邊裝邊敲實(shí)此柱，再加入1.0g無(wú)水硫酸鈉，上端再放一濾紙片，用活塞適度壓實(shí)樣品，取出活塞。用20mL乙酸乙酯洗脫劑分3次洗脫，燒杯接收洗脫液。40水浴，氮吹儀吹干洗脫液；用2mL甲醇溶解杯中殘留物，并經(jīng)0.45m針頭過(guò)濾器濾至2mL定量管中定容，待測(cè)定。2 結(jié)果與討論2.1 基質(zhì)固相分散萃取蔬菜中二甲戊樂(lè)靈條件的選擇和優(yōu)化在基質(zhì)固相分散萃取中，固相萃取材料的選擇、洗脫劑的極性和用量、樣品與固相萃取材料的比例是影響前處理效果的4個(gè)最主要因素，只有優(yōu)化了這些參數(shù)才能同時(shí)得到理想的凈化效果和回收率。固相萃取材料和洗脫劑的選擇直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇正確的洗脫劑和固相萃取材料的組合，能有效提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。合適的固相萃取材料可以把目標(biāo)農(nóng)藥有效提取出來(lái)，而較少提取油脂、蛋白、色素等雜質(zhì)；合適的洗脫劑能將目標(biāo)農(nóng)藥從凈化柱上徹底洗脫下來(lái)，而將油脂、蛋白和色素等雜質(zhì)保留在凈化柱上，因此合適的固相萃取材料和洗脫劑及其用量對(duì)蔬菜中殘留農(nóng)藥的提取、分離凈化是至關(guān)重要的。除非另有說(shuō)明，所有條件的選擇和優(yōu)化結(jié)果都是用山藥樣品，添加二甲戊樂(lè)靈的濃度為1.0mg/kg，進(jìn)行三次平行樣測(cè)定的平均值。2.1.1 基質(zhì)固相分散萃取吸附劑的選擇在基質(zhì)固相分散中，固相萃取吸附劑同時(shí)起著支持劑、吸附劑、凈化劑的作用，待測(cè)農(nóng)藥在填料與樣品基質(zhì)之間進(jìn)行吸附與分配，最終達(dá)到提取與凈化雙重效果。對(duì)C18和弗羅里硅土兩種吸附劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了試驗(yàn)，其加標(biāo)回收率分別為78.8%和90.2%，而相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.3%和1.5%。由此可見(jiàn)，對(duì)提取蔬菜中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥來(lái)說(shuō)，弗羅里硅土吸附劑更合適。2.1.2 樣品與吸附劑量的比率選擇 樣品與吸附劑量的比率對(duì)分析結(jié)果影響很大。文獻(xiàn)報(bào)道，樣品和鍵合相載體的最佳比率是1:4，大多數(shù)MSPD柱中典型的樣品用量為0.5g11。分別試驗(yàn)了樣品與弗羅里硅土吸附劑量的比率為1：2，1：3，1：4和1：5，其結(jié)果列于表1。從結(jié)果看，當(dāng)樣品與吸附劑的比率從1；2逐步提高到1；4時(shí)，二甲戊樂(lè)靈的回收率也隨著增加；但樣品與吸附劑比表 1 不同樣品-吸附劑比率對(duì)二甲戊樂(lè)靈回收率的影響Tab. 1 Effect of different ratio of sample-sorbent on recovery of pendimethalin樣品-吸附劑比率二甲戊樂(lè)靈回收率，%RSD，%1：269.12.51：378.43.71：490.21. 51：588.53.3率提高到1：5時(shí)，其回收率反而降低。1：4時(shí)二甲戊樂(lè)靈回收率和測(cè)定的RSD最佳，此與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果吻合。所以，確定樣品與弗羅里硅土吸附劑量的比率為1：4。2.1.3 洗脫劑和用量的選擇理想的洗脫溶劑應(yīng)滿足以下兩個(gè)要求:(1)溶劑強(qiáng)度足夠大，即使用該洗脫溶劑時(shí)分析物的保留因子KW盡可能小;(2)溶劑應(yīng)與后續(xù)的檢測(cè)方法相適應(yīng)12。分別試驗(yàn)了正己烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯對(duì)二甲戊樂(lè)靈的洗脫效果，其結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，正己烷為洗脫劑時(shí)洗脫不完全，加標(biāo)回收率偏低；甲醇和乙腈為洗脫劑時(shí)加標(biāo)回收率已大于70%，二者效果基本相當(dāng)；而乙酸乙酯對(duì)二甲戊樂(lè)靈的洗脫效果最好，加標(biāo)回收率已大于90%。因此確定乙酸乙酯為本工作的洗脫劑。洗脫劑的用量以既能對(duì)目標(biāo)分析物有很好的溶解、洗脫能力，同時(shí)又能對(duì)基質(zhì)雜質(zhì)洗脫較少為準(zhǔn)則。圖3是乙酸乙酯洗脫劑用量對(duì)影響洗脫二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥的曲線圖。由圖3可看出，隨著乙酸乙酯用量的增大二甲戊樂(lè)靈的回收率也增大；當(dāng)用量為20mL時(shí)，其回收率已高于90%；但當(dāng)用量繼續(xù)增加時(shí)，回收率增幅趨于平緩。所以，本研究選擇乙酸乙酯洗脫劑的用量為20mL。2.2 二甲戊樂(lè)靈測(cè)定的線性范圍用甲醇稀釋二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制不同濃度的二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，其線性范圍為0.02-2.0mg/L，r0.999。圖2 洗脫劑的選擇Fig. 2 Selection of eluting solvent圖3 洗脫劑用量對(duì)萃取效率的影響Fig. 3 Effect of amount of eluting solvent on extraction efficiency2.3 樣品測(cè)定、加標(biāo)回收率、精密度和檢出限在馬鈴薯、胡蘿卜和山藥樣品中分別加入不同量的二甲戊樂(lè)靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，用上述研究的方法測(cè)定了樣品。以胡蘿卜樣品為例，加標(biāo)前后經(jīng)MSPD萃取后洗脫液的色譜圖分別描繪于圖4(a)和圖4(b)中。比較這二張圖可見(jiàn)，在約3min處，能明顯看到加標(biāo)后的色譜圖上增加的那個(gè)峰即二甲戊樂(lè)靈。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算了加標(biāo)回收率、測(cè)定精密度和檢出限（S=3s），其結(jié)果列于表2。由表2可知，三種樣品的不同加標(biāo)量的加標(biāo)回收率和測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別在84.5-92.5%和2.2-5.2%范圍內(nèi)。對(duì)添加低濃度水平的樣品的測(cè)定，計(jì)算得到的方法檢出限在11-20mg/kg范圍內(nèi)。在三種樣品中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留量均小于方法檢出限，未檢出。 3 結(jié)論本文研究了以弗羅里硅土為基質(zhì)固相萃取吸附劑，乙酸乙酯為洗脫劑的基質(zhì)固相分散萃取富集蔬菜樣品中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥殘留的前處理方法，并結(jié)合高效液相色譜法和外標(biāo)法定性定量測(cè)定幾種蔬菜樣品中二甲戊樂(lè)靈農(nóng)藥的方法。樣品前處理簡(jiǎn)便快速，不需要特殊的儀器設(shè)備，有機(jī)溶劑用量較少，成本低，方法的推廣性強(qiáng)?；|(zhì)固相分散萃取富集蔬菜樣品中二甲戊樂(lè)靈的最佳條件如下：樣品與弗羅里硅土吸附劑的比率為1：4（0.5g樣：2g弗羅里硅土）；洗脫劑為20mL乙酸乙酯，分3次加入。色譜最佳條件：流動(dòng)相100%甲醇、流速0.8mL/min、柱溫25C、檢測(cè)波長(zhǎng)235nm。二甲戊樂(lè)靈的測(cè)定線性范圍為0.02-2.0mg/L、 r0.999。在幾種蔬菜中的加標(biāo)回收率在84.5-92.5范圍內(nèi)，測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2-5.2；方法檢出圖4(a) 胡蘿卜MSPD萃取后洗脫液色譜圖Fig. 4(a) Chromatogram of elution solution after extraction of carrot by MSPD圖4(b) 加標(biāo)胡蘿卜MSPD萃取后洗脫液色譜圖Fig. 4(b) Chromatogram of elution solution after extraction of spiked carrot by MSPD表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=6)Tab. 2 results of determination of samplesmg/kg樣品名稱樣品測(cè)得量加標(biāo)量測(cè)得加標(biāo)量SD回收率，%RSD，%DL（S=3s）馬鈴薯-200171685.53.518-10008864688.65.2-20001.79x1036x1089.53.4胡蘿卜-200169884.54.720-10008842888.43.2-20001.78x1034x1089.02.2山藥-200179689.53.411-10009082490.82.6-20001.85x1034x1092.52.2“-”：未檢出。 限為11-20mg/kg。參考文獻(xiàn)1張智超，曾 敏，李朝陽(yáng)等. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，7（3）：2642 霍江蓮, 李軍，葛毅強(qiáng)等. 分析化學(xué)，2006，34(特刊)：S633 黃雅麗，毛黎娟，吳慧明等. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2004，23（6）：11474李菊清，周孝瑞，曾仲武. 分析化學(xué)，2001，29（5）：6145 杜紅霞，王文博，丁蕊艷等. 化學(xué)分析計(jì)量，2006，15（6）：826Garrido-Frenich A, Arrebola F J, Gonzlez-Rodrguez M J et al. 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The effects of different extraction conditions (extraction sorbent, ratio of sample to sorbent, eluting solvent and their amount, and etc.) and determination conditions were studied; and the op