方法建立與驗(yàn)證

12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 1 第四章體內(nèi)藥物分析方法的建立與驗(yàn)證 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 2 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)分析方法建立的一般步驟分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容與要求體內(nèi)藥物分析應(yīng)用示例 本章內(nèi)容提要 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 3 第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 建立分析檢測(cè)方法的主要依據(jù)待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況分析測(cè)定的目的與要求生物樣品的類型與預(yù)處理方法實(shí)驗(yàn)室條件 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 4 一 待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況 準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中的藥物或其特定代謝物 預(yù)處理 待測(cè)物從結(jié)合物或綴合物中釋放選擇樣品預(yù)處理方法 首先應(yīng)考慮 待測(cè)藥物的理化性質(zhì) 藥物在生物體內(nèi)的存在狀況 藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化 代謝 途徑 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 5 一 待測(cè)藥物的理化性質(zhì) 藥物的pKa值 親脂性 溶解度 分配系數(shù)等 預(yù)處理及檢測(cè)方法具有親脂性 在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取具有強(qiáng)極性或親水性 沉淀蛋白 固相萃取 離子對(duì)萃取或衍生化后萃取等具有揮發(fā)性 GC測(cè)定法具有光譜或電化學(xué)特性 分析檢測(cè)方法藥物的穩(wěn)定性 萃取濃縮技術(shù)對(duì)酸堿不穩(wěn)定 避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶劑對(duì)熱不穩(wěn)定 避免高溫蒸發(fā)溶劑 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 6 二 待測(cè)藥物的體內(nèi)存在狀態(tài) 與血漿蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱及結(jié)合率的高低 分離萃取方法 蛋白結(jié)合較強(qiáng) 不宜直接采用溶劑萃取 體內(nèi)濃度高低 代謝過(guò)程及其代謝產(chǎn)物 分析檢測(cè)技術(shù) 濃度較低 尤其有代謝產(chǎn)物共存 代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時(shí)測(cè)定 采用LC MS EIA等分析檢測(cè)技術(shù) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 7 二 分析測(cè)定的目的與要求 體內(nèi)藥物分析的目的 影響分析方法的應(yīng)用 藥代動(dòng)力學(xué) 研究藥物在體內(nèi)吸收 分布 代謝和排泄過(guò)程 血漿濃度隨時(shí)間的變化過(guò)程 代謝途徑及代謝產(chǎn)物要求 同時(shí)測(cè)定原形藥物和代謝產(chǎn)物檢測(cè) 寬線性范圍 Cmax Cmax的1 20 高靈敏度 10 9g ml 和高專屬性 分離能力 原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離 方法 不必強(qiáng)調(diào)方法的簡(jiǎn)便 快速 大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù) 如HPLC LC MS 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 8 二 分析測(cè)定的目的與要求 臨床治療藥物監(jiān)測(cè) 有效治療濃度范圍內(nèi)藥物濃度方法 盡量簡(jiǎn)便 易行 適用于長(zhǎng)期 批量樣品的測(cè)定 大多采用UV RIA或EIA等 中毒患者的臨床搶救 藥物濃度極高方法 不必強(qiáng)調(diào)方法的靈敏度 強(qiáng)調(diào)方法的特異性和分析速度 大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC GC MS RIA或EIA 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 9 三 生物樣品的類型與預(yù)處理方法 生物樣品的類型與預(yù)處理方法 決定分析方法的應(yīng)用 以血漿或血清為分析樣品采用蛋白沉淀 溶劑萃取預(yù)處理技術(shù) 分析樣品較為 干凈 可用HPLC檢測(cè) 用RIA分析 樣品的預(yù)處理方法可較為粗放 經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測(cè)定 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 10 四 實(shí)驗(yàn)室條件 在設(shè)計(jì)體內(nèi)藥物分析方法時(shí) 還應(yīng)充分考慮到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的或有可能在其它實(shí)驗(yàn)室使用的儀器裝備 合理選擇可行的分析方法 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第一節(jié)分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 11 第二節(jié)分析方法建立的一般步驟 一 分析方法的選擇二 分析方法的建立 一 檢測(cè)條件的篩選 二 分離條件的篩選 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 12 一 分析方法的選擇 體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計(jì)生物樣品中的藥物濃度 決定分析方法的首要因素生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低 樣品量少 難以通過(guò)增加取樣量提高方法靈敏度 通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求體內(nèi)藥物分析中常用分析方法 特點(diǎn)見(jiàn)表4 1 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 13 二 分析方法的建立 分析方法建立之前查閱文獻(xiàn)資料 充分了解藥物在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程 使所擬定的分析方法 避免受到代謝產(chǎn)物的干擾適用于實(shí)際生物樣品測(cè)定 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 14 二 分析方法的建立 初步擬定分析方法后進(jìn)行一系列試驗(yàn)工作 選擇最佳分析條件同時(shí)驗(yàn)證分析方法的可行性 確認(rèn)是否適用于實(shí)際生物樣品分析方法的建立和驗(yàn)證過(guò)程 是不可截然劃分的 為便于討論而分別敘述分析方法的建立步驟第一步 檢測(cè)條件的篩選第二步 分離條件的篩選 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 15 一 檢測(cè)條件的篩選 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 照擬定的分析方法 不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理 測(cè)定 確定最佳分析檢測(cè)條件 如色譜條件 和檢測(cè)靈敏度HPLC 調(diào)整檢測(cè)器 類型 條件 色譜柱 型號(hào) 牌號(hào) 填料性狀與粒經(jīng) 柱長(zhǎng)度 流動(dòng)相 組分及其配比 及其流速柱溫 進(jìn)樣量 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等 使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度 LOQ 良好的色譜參數(shù) n R T 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間 tR 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 16 二 分離條件的篩選 在進(jìn)行分離條件篩選時(shí) 應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對(duì)分離與檢測(cè)的干擾 步驟如下 1 空白溶劑試驗(yàn) 溶劑 方法特異性 2 空白生物基質(zhì)試驗(yàn) endogenouscompounds 方法特異性 3 模擬生物樣品試驗(yàn) 方法效能指標(biāo)4 實(shí)際生物樣品測(cè)試 代謝產(chǎn)物 方法特異性 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 17 1 空白溶劑試驗(yàn) 待測(cè)藥物的非生物基質(zhì)溶液 通常為水溶液 采用擬定的分析方法進(jìn)行衍生化反應(yīng) 萃取分離等樣品預(yù)處理 反應(yīng)試劑 衍生化試劑 萃取溶劑等 測(cè)定響應(yīng)信號(hào) 如HPLC峰面積或峰高 考察目標(biāo) 方法的特異性 空白值應(yīng)盡可能小 并能有效校正 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 18 色譜分析法 可通過(guò)改變反應(yīng)條件 萃取方法或萃取條件 萃取溶劑的極性 混合溶劑的配比 固相萃取填料性質(zhì) 沖洗劑與洗脫劑及其用量等 甚至檢測(cè)器類型 空白試劑信號(hào)應(yīng)不干擾藥物的測(cè)定 如R 1 5 本步驟主要考察 需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過(guò)程 若預(yù)處理過(guò)程僅為生物樣品的提取分離 則可不進(jìn)行該步驟 直接進(jìn)行空白生物基質(zhì)試驗(yàn) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 19 2 空白生物基質(zhì)試驗(yàn) 空白生物基質(zhì) blankbiologicalmatrix 如空白血漿 照 1 空白溶劑試驗(yàn) 項(xiàng)下方法操作考察目標(biāo) 生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾 方法特異性 在待測(cè)藥物 或特定的活性代謝物 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等 的 信號(hào)窗 信號(hào)附近的有限范圍 內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號(hào) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 20 3 模擬生物樣品試驗(yàn) 模擬生物樣品 質(zhì)量控制 QC樣品 空白生物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物 照 1 空白溶劑試驗(yàn) 項(xiàng)下方法操作考察目標(biāo) 方法的線性范圍 精密度與準(zhǔn)確度 靈敏度藥物的萃取回收率等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo) 同時(shí)進(jìn)一步檢驗(yàn)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對(duì)測(cè)定的干擾程度 即方法特異性 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 21 色譜分析法 進(jìn)一步考察待測(cè)藥物 或內(nèi)標(biāo)物 與內(nèi)源性物質(zhì) 或其它藥物 的分離情況 色譜峰的tR n和T是否與水溶液的一致色譜峰是否為單一成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著偏離零點(diǎn)等 內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)待測(cè)藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 22 4 實(shí)際生物樣品的測(cè)試 空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗(yàn) 確定的分析方法及其條件 不能完全確認(rèn)是否適合于實(shí)際生物樣品的測(cè)定 藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合 如血漿蛋白結(jié)合物 或代謝生成數(shù)個(gè)代謝產(chǎn)物及其進(jìn)一步的結(jié)合物 或綴合物 實(shí)際生物樣品 確立分析方法后 尚需進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)試考察目標(biāo) 代謝產(chǎn)物對(duì)藥物 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況 進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第二節(jié)分析方法的建立步驟 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 23 第三節(jié)分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容與要求 用于實(shí)際生物樣品分析之前 驗(yàn)證 validation 分析方法的可行性與可靠性方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮影響分析方法 所有可變因素 采樣 樣品制備 色譜分離 檢測(cè)與數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)等 使用的技術(shù)指標(biāo) 效能指標(biāo)使用的樣品 通常采用模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 24 驗(yàn)證步驟 首先為分析方法的驗(yàn)證 特異性 精密度與準(zhǔn)確度 回收率定量限與檢測(cè)限 溶液穩(wěn)定性其次為生物基質(zhì)中待測(cè)藥物穩(wěn)定性的驗(yàn)證 室溫放置 冷凍 或冷藏 凍 融循環(huán) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 25 驗(yàn)證的效能指標(biāo)與基本要求 1 特異性 避免干擾2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 覆蓋所有濃度范圍3 準(zhǔn)確度 與實(shí)際狀況相符4 精密度 結(jié)果可重現(xiàn)5 定量限 達(dá)到峰濃度的1 10 1 206 穩(wěn)定性 確保所有樣品準(zhǔn)確測(cè)定7 提取回收率 確保準(zhǔn)確度 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 26 一 方法特異性 專屬性或選擇性 方法的特異性 specificity 又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?通常與選擇性 selectivity 互用 系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí) 方法準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的能力專屬性 表示所檢測(cè)的信號(hào) 響應(yīng) 系屬于待測(cè)藥物所特有的選擇性 系指將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分 分離 的能力特異性 函蓋二者 以驗(yàn)證所測(cè)定的物質(zhì)與待測(cè)藥物的同一性考察一個(gè)分析方法是否具有特異性 應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 27 1 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾 比較 待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)對(duì)照品 或標(biāo)準(zhǔn)品 空白生物基質(zhì)模擬生物樣品 空白生物基質(zhì)中添加對(duì)照品 如HPLC色譜峰的tR n和T是否一致及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的R確證 內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法有無(wú)干擾 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 28 2 代謝產(chǎn)物的干擾 比較 模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào)與代謝產(chǎn)物 在實(shí)際樣品中tR隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加 的R如HPLC色譜峰的tR n和T 或改變色譜條件 色譜柱 再比較 確證 其它代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法有無(wú)干擾結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測(cè)定 必要時(shí)通過(guò)HPLC DAD和LC MS確證色譜峰的單純性和同一性對(duì)于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測(cè)定 可采用LC LC NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)的初步推測(cè)后 考察其干擾情況 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 29 3 伍用藥物的干擾 TDM時(shí) 還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物 通常為數(shù)有限 的干擾比較 待測(cè)藥物及可能同時(shí)服用藥物的模擬生物樣品的檢測(cè)信號(hào) 如HPLC色譜峰的tR n和T是否一致確證 同時(shí)服用藥物對(duì)分析方法的干擾情況 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 30 4 與參比方法的相關(guān)性 除上述方法外 有時(shí)還可使用參比方法對(duì)照參比方法一般選用特異性強(qiáng) 準(zhǔn)確度高 線性關(guān)系良好的色譜法 如在TDM中使用UV 或RIA 時(shí) 可以HPLC 或GC 為參比參比方法測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo) X 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo) Y 用最小二乘法計(jì)算回歸方程Y a bX 坐標(biāo)標(biāo)度相等 相關(guān)系數(shù) r 表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性 若r 1 表示擬定方法為非線性 如RIA中抗血清滴度選擇不當(dāng) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 31 4 與參比方法的相關(guān)性 Y a bX截距 a 表示擬定方法受到恒定干擾的程度 內(nèi)源性物質(zhì) UV 斜率 b 表示擬定方法受到比例干擾的程度 標(biāo)記抗原不純 RIA 與參比方法的相關(guān)性比較 除顯示分析方法的特異性外 斜率b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性若參比方法準(zhǔn)確度良好 若截距a 0 則擬定方法的準(zhǔn)確度 回收率 為100b 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 32 二 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線 standardcurve calibrationcurveorworkingcurve 生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性 比例的程度 通常用回歸分析方法所得的回歸方程來(lái)評(píng)價(jià) 除少數(shù)方法 免疫分析法 外 標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式 回歸分析法為最小二乘法 leastsquares 或加權(quán)最小二乘法 weightedleastsquares 線性范圍 linearrang 標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 模擬生物樣品的測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 33 二 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 續(xù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用模擬生物樣品建立 線性范圍 不包括零點(diǎn) 應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品 應(yīng)使用與待測(cè)的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 34 標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法 1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 非生物基質(zhì)溶液 的制備溶劑 水或甲醇 或其他適當(dāng)溶劑 濃度 標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上加入量為生物樣品總體積的2 以下避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實(shí)際樣品存在較大差異濃度較低 應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì)否則 在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 35 2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍 至少含5 8個(gè)濃度點(diǎn) 不包括零點(diǎn) 即空白 可覆蓋全部待測(cè)生物樣品中的藥物濃度如 1 2 5 10 20 50 100 等比梯度模式 比例常數(shù)約為2 若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50 其1 20為2 5設(shè)定最高濃度為100 最低濃度為1 個(gè)體差異 實(shí)際制備時(shí) 500 250 100 50 20 10 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 36 3 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì) 如血漿 加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量 渦旋混勻?yàn)榉乐乖跇?biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時(shí)造成的損失 先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 再加入空白生物基質(zhì) 渦旋混勻 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 37 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng) 如色譜峰面積或峰高 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值 內(nèi)標(biāo)法 因變量 y 對(duì)模擬血藥濃度 自變量 x 求得回歸方程 y a bx 及其相關(guān)系數(shù) 在一組由至少7個(gè)濃度 不包括零點(diǎn) 構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中 至多可有2個(gè)濃度點(diǎn)數(shù)據(jù) 可予剔除 但應(yīng)有確切原因 如 樣品處理有損失 色譜圖有問(wèn)題 或 顯著偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線 該數(shù)據(jù)參與標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸后 計(jì)算QC樣品或返算該點(diǎn)濃度時(shí)顯著偏離其標(biāo)稱濃度 配制濃度 其余應(yīng)有至少5個(gè)濃度點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 38 5 加權(quán)最小二乘法 最小二乘法 每個(gè)濃度點(diǎn)絕對(duì)誤差 yi yi 賦予同等的重要性標(biāo)準(zhǔn)曲線上的高低濃度相差懸殊 范圍達(dá)102 低濃度區(qū)的計(jì)算值相對(duì)誤差過(guò)大 難以滿足規(guī)定要求加權(quán)最小二乘法 回歸計(jì)算時(shí)增加一個(gè)權(quán)重因子 w 各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對(duì)離差平方和達(dá)到最小式中 wi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上第i個(gè)濃度點(diǎn)的權(quán)重因子 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 39 1 回歸方程 y a bx 參數(shù)的計(jì)算 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 40 2 權(quán)重因子的選擇 加權(quán) 賦予低濃度點(diǎn)以更大的權(quán)重在實(shí)際工作中的一般方法 當(dāng)wi 1 yi 2時(shí) 則 而yi與xi成正比 所以 令wi 1 bxi 2 k xi2 通常取wi 1 C2 當(dāng)高濃度點(diǎn)測(cè)量值的準(zhǔn)確度下降過(guò)大 低濃度點(diǎn)權(quán)重過(guò)大 降低低濃度點(diǎn)的權(quán)重 wi k xi 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 41 標(biāo)準(zhǔn)曲線的限度要求 藥代動(dòng)力學(xué)或生物利用度研究 標(biāo)準(zhǔn)曲線至少包括5個(gè)濃度 通常為5 8個(gè)濃度 不包括零點(diǎn) 最高濃度應(yīng)高于達(dá)峰濃度 Cmax 最低濃度應(yīng)低于Cmax的10 5 并應(yīng)為方法的LOQ 非LOD 回歸方程的截距應(yīng)接近于零 相關(guān)系數(shù)要求 0 99 色譜法 或 0 98 生物學(xué)方法 若非線性 可分為高低兩個(gè)濃度區(qū)間 每個(gè)區(qū)間不少于5個(gè)濃度 分別加權(quán)回歸 如1 2 5 10 20和10 20 50 100 200 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 42 三 準(zhǔn)確度 方法準(zhǔn)確度 accuracy 系指用該方法測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程度 應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定 但實(shí)際生物樣品的濃度是未知的所以 通常使用模擬生物樣品測(cè)定 一般用相對(duì)回收率 relativerecovery RR 或相對(duì)誤差 relativeerror RE 表示 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 43 1 測(cè)定法 取空白生物基質(zhì) 如血漿 數(shù)份 照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作 用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控 qualitycontrol QC 樣品 高 接近上限 中 低 接近LOQ 3個(gè)濃度 每一濃度至少5個(gè)樣本 與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測(cè)定 計(jì)算 每個(gè)樣品分析測(cè)定1次 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 44 2 結(jié)果計(jì)算與限度要求 計(jì)算 測(cè)定值M measured 平均值與理論濃度 加入值 A added 比值相對(duì)回收率相對(duì)誤差限度要求 相對(duì)回收率應(yīng)在85 115 LOQ附近80 120 RE在 15 LOQ附近為 20 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 45 四 精密度 方法精密度 precision 系指每次測(cè)定結(jié)果與多次測(cè)定的平均值的偏離程度 表示該分析方法的可重復(fù)性 reproducibility 反映分析方法的可操作性 是方法驗(yàn)證的基本要點(diǎn)之一實(shí)際生物樣品的量有限 如血漿 一般為0 5 2ml 使用模擬生物樣品測(cè)定 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 46 1 表示方法 方法精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差 standarddeviation SD 或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 relativestandarddeviation RSD 表示SD RSD 包括批內(nèi) within run或intra assay RSD 日內(nèi) within day 和批間 between run或inter assay RSD 日間 between day day to day 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 47 2 測(cè)定法 分別測(cè)定法 照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法 取空白生物基質(zhì) 如血漿 數(shù)份 分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高 中 低3個(gè)濃度的QC樣品 并分析測(cè)定批內(nèi)RSD 每一濃度5 6個(gè)樣品 每個(gè)樣品測(cè)定1次 用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個(gè)濃度及每1濃度的RSD批間RSD 每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個(gè)樣品 每個(gè)樣品測(cè)定1次 用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3個(gè)濃度 每一濃度5 6個(gè)分析批數(shù)據(jù) 的RSD 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 48 2 測(cè)定法 連續(xù)測(cè)定法 若實(shí)際樣品測(cè)定所用的分析批次少于5批 也可進(jìn)行3個(gè)批次的連續(xù)分析 每1濃度的每1批次為5 6個(gè)樣本 方差分析法批間RSD 批內(nèi)RSD 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 49 3 限度要求 在藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究中對(duì) g ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng) 10 ng ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng) 15 在LOQ附近RSD應(yīng) 20 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 50 五 定量限 方法定量限 limitofquantitation LOQ 系指在保證具有一定可靠性 準(zhǔn)確度與精密度符合要求 的前提下 能測(cè)定出生物樣品中藥物的最低濃度 又稱為方法靈敏度 sensitivity 標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn) 最低濃度點(diǎn) LOQ 要求 應(yīng)能滿足測(cè)定3 5個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度 準(zhǔn)確度在80 120 或RE在 20 的范圍內(nèi) RSD 20 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 51 六 穩(wěn)定性與質(zhì)量控制 穩(wěn)定性 包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性方法穩(wěn)定性 方法的耐用性樣品穩(wěn)定性 生物樣品的存放條件和時(shí)間 凍 融循環(huán)測(cè)定法 QC樣品穿插于實(shí)際樣品測(cè)定全過(guò)程 模擬 或?qū)嶋H 生物樣品及其預(yù)處理后的待測(cè)溶液進(jìn)行考察要求 準(zhǔn)確度85 115 RE在 15 范圍內(nèi) RSD 15 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 52 七 萃取回收率 生物樣品的預(yù)處理方法 重點(diǎn)考慮方法準(zhǔn)確度 或相對(duì)回收率 操作簡(jiǎn)便 快速 萃取回收率 絕對(duì)回收率 absoluterecovery 70 萃取回收率與相對(duì)回收率的意義不同萃取回收率 考察生物樣品預(yù)處理過(guò)程造成的藥物的程度損失相對(duì)回收率 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計(jì)算生物樣品中藥物濃度 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 53 1 測(cè)定法 取空白生物基質(zhì) 如血漿 照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法 制備高 中 低3個(gè)濃度的QC樣品 每一濃度至少5個(gè)樣品 每個(gè)樣品分析測(cè)定1次另取等量的相同3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘?jiān)娜軇┫♂屩镣w積 同法測(cè)定AT 經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測(cè)信號(hào)或比值 內(nèi)標(biāo)法 AS 未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)信號(hào)或比值 內(nèi)標(biāo)法 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 54 2 限度要求 萃取回收率一般應(yīng) 50 高 中濃度的RSD應(yīng) 15 低濃度的RSD應(yīng) 20 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 55 第四節(jié)體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例 第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究一 文獻(xiàn)調(diào)研性質(zhì) 在水中溶解 在甲醇中微溶 在乙醇中極微溶解 在氯仿中幾乎不溶 在氫氧化鈉試液中易溶 環(huán)丙沙星游離體在水中不溶 在乙醇 二氯甲烷中極微溶解 在稀醋酸中溶解 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 56 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 吸收過(guò)程 空腹口服后吸收迅速 人體生物利用度約為49 70 Cmax 口服500mg后平均Cmax為2 4 2 6mg LTmax 1 2hT1 2 血中T1 2約為4h 腎功能減退時(shí)稍有延長(zhǎng)至6h蛋白結(jié)合率 20 40 代謝 口服給藥24h內(nèi) 40 50 原形 15 代謝物經(jīng)腎排出 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 57 體內(nèi)分析方法 RP HPLC色譜柱 ODS色譜柱流動(dòng)相 甲醇 乙腈 磷酸 枸櫞酸 緩沖液 三乙胺調(diào)節(jié)pH2 3 3 5 或離子對(duì)色譜 溴化十六烷基三甲基銨 氫氧化四丁基銨 檢測(cè) 紫外或熒光檢測(cè)生物樣品預(yù)處理蛋白沉淀法 甲醇 乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣溶劑萃取法 二氯甲烷 異丙醇 氯仿 異丙醇混合溶劑蛋白沉淀 溶劑萃取 乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷 異丙醇提取 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 58 二 分析方法設(shè)計(jì) 1 分析方法血漿蛋白結(jié)合率低 20 40 以原形從腎排泄生物等效性研究 測(cè)定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度 時(shí)間曲線 初步擬定 采用RP HPLC法2 檢測(cè)方法紫外 靈敏度 1ng 若取血漿0 5ml 采用3倍量乙腈沉淀蛋白 取上清液100 l進(jìn)樣 則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng ml以上 當(dāng)Cmax在2 g ml以上 口服500mg 時(shí)基本可滿足生物等效性研究要求熒光 靈敏度 0 1ng 能滿足本試驗(yàn)要求 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 59 二 分析方法設(shè)計(jì) 續(xù) 3 樣品制備方法初步擬定 采用簡(jiǎn)便 快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進(jìn)樣分析預(yù)試 含75 乙腈的提取液100 l進(jìn)樣后 色譜峰理論板數(shù) 對(duì)稱性下降 前沿峰 進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低 峰高降低 經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn) 確定為 血漿0 5ml 乙腈1ml沉淀蛋白 二氯甲烷 異丙醇 95 5 5ml萃取 60 氮?dú)饬鞔蹈?流動(dòng)相200 l溶解 20 l進(jìn)樣靈敏度可達(dá)2ng ml 血漿濃度 符合要求 Cmax 2 g ml 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 60 三 實(shí)驗(yàn)方案 1 給藥方案20名受試者隨機(jī)分為兩組 每組10人第1次試驗(yàn) 第一組口服受試制劑 相當(dāng)于環(huán)丙沙星500mg 第二組口服相同劑量的參比制劑第2次試驗(yàn) 第1次服藥后第7天開(kāi)始 兩組交換給藥 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 61 三 實(shí)驗(yàn)方案 續(xù) 2 血樣的采集與處理分別口服給藥前和給藥后0 25 0 5 1 0 1 5 tmax 2 0 3 0 4 0 6 0 8 0 12 0和24 0 5 7個(gè)t1 2 小時(shí)由肘正中靜脈取血4ml立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中 靜置5分鐘后 離心15分鐘 3000rpm 分離血漿 20 冰箱中保存待測(cè) 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 62 三 實(shí)驗(yàn)方案 續(xù) 3 血樣分析法色譜條件 高效液相色譜儀 包括LC 10ATvp泵 RF 530熒光檢測(cè)器 色譜柱為KromasilODS AP 200mm 4 6mm 5 m 流動(dòng)相為乙腈 0 025mol L磷酸溶液 86 14 流速1 0ml min 檢測(cè)波長(zhǎng)為 ex 277nm em 445nm 柱溫為40 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 63 三 實(shí)驗(yàn)方案 續(xù) 3 血樣分析法血漿樣品的預(yù)處理取血漿0 5ml 加內(nèi)標(biāo)溶液 10 g ml諾氟沙星甲醇溶液 50 l 乙腈1 0ml 渦旋混合30s 離心5min 取上清液1ml 加二氯甲烷 異丙醇 95 5 混合溶劑5ml 渦旋振蕩1min 離心5min 棄去上層水相 吸取下層有機(jī)相 60 下氮?dú)饬鞔蹈?殘?jiān)恿鲃?dòng)相200 l 渦旋溶解30s 離心5min 取上清液20 l進(jìn)樣 第四章分析方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié)分析方法的驗(yàn)證與要求 12 04 2020 體內(nèi)藥物分析 64 四 分析方法驗(yàn)證 1 方法特異性環(huán)