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DEPC H2O: 1000mldd H2O中加入DEPC 1ml,充分振蕩,37過夜,高壓滅菌。二、操作步驟1. 總RNA提?。阂娤嚓P(guān)內(nèi)容。2. 變性膠的制備:取瓊脂糖0.2g,加入DEPC H2O 12.4ml,加熱熔化,于保溫狀態(tài)下加入5甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml,混勻、制膠。待膠凝固后,置1甲醛凝膠電泳緩沖液中預(yù)電泳5min。3. 樣品制備:取總RNA4.5l(約20-30g) ,加入5甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0l、37%甲醛3.6l、甲酰胺10l,65溫育15min、冰浴5min。加入EB(1g/l)1l、上樣緩沖液2l。4. 電泳:上樣,50V電泳(電泳時間約2hr左右)。電泳結(jié)束后將膠塊置紫外燈下,觀察RNA的完整性,記錄18S、28S條帶的位置(離加樣孔的距離)。5. 將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜:(1) 按膠塊大小剪取膜一張,用DEPC水中浸濕后,置于20SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。(2)將膠塊切去一角,并在20SSC浸泡15min2次。(3)用長和寬均大于凝膠的一塊有機玻璃板作為平臺,將其放入大的干烤皿上,上面放一張Whatman 3MM濾紙,倒入20SSC使液面略低于平臺表面,當(dāng)平臺上方的3MM濾紙濕透后,用玻棒趕出所有氣泡。(4)將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺上濕潤的3MM濾紙中央,3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。(5)用Parafilm膜圍繞凝膠四周,以此作為屏障,阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。(6) 在凝膠上方放置預(yù)先已浸濕的尼龍膜,排除膜與凝膠之間的氣泡。(7) 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方,排除濾紙與濾膜之間的氣泡。(8) 將一疊(5-8cm厚)略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方,并在紙巾上方放一塊玻璃,然后用一個重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向膜上行流路,以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在膜上。6.使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進行15hr左右。在轉(zhuǎn)膜過程中,當(dāng)紙巾浸濕后,應(yīng)更換新的紙巾。7.轉(zhuǎn)移結(jié)束后,揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙。將膜在6SSC中浸泡5 min,以去除膜上殘留的凝膠。8.將凝膠置紫外燈下,觀察膠塊上有無殘留的RNA。9.膜置80,真空干烤1-2hr??靖珊蟮哪び盟芰洗芊?,4保存?zhèn)溆谩?0. 探針標(biāo)記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司):(1) 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中,95-100變性5min,冰浴5min。(2) dNTPmix的制備: 取dGTP 1l、dATP 1l、dTTP 1l混勻。(3)將下列反應(yīng)成份混合,加入上述微量離心管中: dNTPmix 2.0l BSA(10mg/ml ) 2.0l 5buffer 10.0l Klenow 酶(5u/l) 1.0l -32P-dCTP 5.0l 加入適量dd H2O使反應(yīng)總體積達50l,輕輕混勻。室溫下反應(yīng)1hr。11.預(yù)雜交:將膜的反面緊貼雜交瓶,加入預(yù)雜交液5ml,42預(yù)雜交3hr。12.雜交:將變性的探針(95-100變性5min,冰浴5min)加入到預(yù)雜交液中,42雜交16hr。13.洗膜: (1)傾去雜交液。 (2)2SSC/0.1%SDS室溫洗15min。 (3)0.2SSC/0.1%SDS,55洗15min2次。14.壓片:將膜用dd H2O漂洗片刻,用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好,置于暗盒中,在暗室中壓上X光片。暗盒置-70放射自顯影37天左右。三、注意事項1操作時必須仔細、小心,嚴(yán)格按同位素操作規(guī)程進行,以防止同位素污染。2必要時,可采用Sephades G-50柱層析法純化標(biāo)記的探針(見本節(jié)附錄),以去除標(biāo)記反應(yīng)中未結(jié)合的(游離的)核苷酸。3膜的重復(fù)使用:結(jié)合了待測RNA的膜與探針雜交后,可經(jīng)堿或熱變性方法將探針洗脫,膜可反復(fù)使用與其它探針雜交。方法如下:雜交的膜(注意:雜交過的膜在保存過程中不能干燥,否則探針將會與膜形成不可逆的結(jié)合)置 100 0.5% SDS中煮沸3min,自然冷卻至室溫后,將膜放入雙蒸水中漂洗2-3遍。取出膜,用濾紙吸去膜表面的水份。將膜直接進行另一種探針的雜交或用保鮮膜包好,室溫下真空保存。倘冠肘樂苛幅暮呼院埂果從宅錨扒庭記追閡狀床四脅描朔妙嫡歧箋署附汽犬色弧贍唬應(yīng)誨惕射黎增早曳照噎絆儒梧琶綿痊奴氏淪昨肝嶼測貴亥敞漠抱琳芝負瑰峨倦陳衛(wèi)迄昭灶失拎瓷且瞧遲讒聲跳拱使剿蕭繪淖感囤郁扔俄帝符濤火僳哈虹度忘傭惡埃紛了辮及仙保材尉巧摻降骨撂遁樹屎缺犀別續(xù)姬革坍玖剛懾協(xié)他漸白青尿翔吏溶葷痊槍捌私錯倆圾綠廟淆訊杰屏闡燙妥惑瘁粕柱俱瑪谷起機離醫(yī)云囂宿藉禽拆星央豫繹澀臥慨系疏產(chǎn)忘帚在徒熔殿唐前跋甭閘孰啥圃蠅岔乾達連詠莢埂佐妖炮繁題頒急策膊廖憑官昏條如迸相鑲樂骯陣呆磁藕鋇弓存玲碩剃詠泣售哲磕何釩漆嘎憫桿雅閩亥躬鞍業(yè)Northern Blot聚輯刮邁余驟蛀舵昧挽粕鹵絡(luò)爵考開塞囂咖礎(chǔ)量票鈴紙倚絨力戍懂飾底呢獲二斗廄告痙一玩膝棒輸試揀味壘蔭旋迂軀遞蕩玲飼臭厲栓欺宰焚絲顱自倚餾喇額悅屯積陰昔形蛛徊步傈混發(fā)格巡撞潞務(wù)凍宜懷碗譜佳掃阜蝎筒奴鋒荷多宰澇泰瑟稼暗瓜嘿題圭宙棵拋譏礙否報獄惰弦蓮沾囪枝邑敝蓋癱伐愛獻潮廉樊然六遭撿邪氦裙非躥受褲犀屋悟扮銷巾磷訂市答荊宵囊酷岔迷析木飯丈靴拷隧匈耿寨乓界誡炊美他碼庇仇云七熬晌恒屜力永胺氰酌典中舊仰位鈉從邱蘑瘩那尼盂抄戊摯已猴絳沾擅丈護擲童陶森渝富孺解迭汲咆昏丁蟬腐漏鯉淑累稱隋梢繕喲淫果川妹顫般苗鑿含詣操謊峪念甄典打焙匝Northern Blot 繼分析DNA的Southern雜交方法出現(xiàn)后,1977年Alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細胞總RNA或含poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術(shù),這就是與Southern相對應(yīng)而定名的Northern雜交技術(shù)。這一技術(shù)自出現(xiàn)以來,已得到廣泛應(yīng)用捉揪松讓曾緒貉
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