Elisa常見類型及實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法與常見問題.doc

精品文檔Elisa常見類型及實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法與常見問題酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種實(shí)驗(yàn)室常用的檢測方法，廣泛應(yīng)用于測量溶液中的分析物（抗體或抗原）的濃度。與其他基于抗體的檢測方法不同的是，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或酶免疫測定（EIA）通過與固相支持物的結(jié)合和系列洗滌步驟，實(shí)現(xiàn)特異性和非特異性相互作用的分離，并可通過最終有色產(chǎn)物的形成，定量分析原始樣品中分析物的含量。ELISA 實(shí)驗(yàn)通常以細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿以及組織裂解物等為樣品。該實(shí)驗(yàn)必備三種試劑：固相的抗原或抗體；酶標(biāo)記的抗原或抗體；酶作用的底物。根據(jù)樣品的性質(zhì)、檢測的實(shí)驗(yàn)條件、試劑的來源，可設(shè)計(jì)出不同類型的ELISA檢測方法。該實(shí)驗(yàn)可迅速分析大量平行樣品，在基礎(chǔ)研究和臨床診斷實(shí)踐中廣泛使用。一、直接ELISA原理：將抗原與固相載體連接，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。加酶標(biāo)抗體進(jìn)行孵育。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。加底物反應(yīng)。直接法主要用于測定抗原。優(yōu)點(diǎn)：操作流程簡短，實(shí)驗(yàn)步驟少；無需使用二抗，避免了交叉反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)步驟少，操作不易出錯。缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)中的一抗需要直接用酶標(biāo)記，成本相對較高。二、間接法ELISA原理：將抗原與固相載體相連結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。加入特異性一抗與固相抗原相結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，加酶標(biāo)二抗。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，加底物顯色。 優(yōu)點(diǎn)：酶標(biāo)二抗可加強(qiáng)信號，提高靈敏度；靈活性更大，同一酶標(biāo)二抗可應(yīng)用于多種不同的一抗；不直標(biāo)一抗，可保留更多的免疫反應(yīng)性；成本更低，使用標(biāo)記抗體更少。缺點(diǎn)：交叉反應(yīng)幾率升高。三、雙抗夾心法ELISA原理：雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子，但不適用于小分子抗原。將特異性抗體（捕獲抗體）與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。加入待檢樣品，保溫孵育。樣品中的特異性抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。加酶標(biāo)抗體（檢測抗體）保溫孵育。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。加底物反應(yīng)。雙抗原夾心法測抗體的反應(yīng)模式與測抗原相似，用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。 優(yōu)點(diǎn)：高特異性，使用的捕獲抗體與檢測抗體都是檢測特異性的；適用于復(fù)雜樣品，抗原不需要進(jìn)行純化即可用于檢測；靈活性更大，靈敏度更高，可采用直接法也可采用間接法。缺點(diǎn)：檢測物需要擁有兩個(gè)以上不同的抗原表位或多個(gè)相同的重復(fù)表位；不適用于檢測小分子物質(zhì)。四、競爭法ELISA原理：競爭法ELISA最為復(fù)雜，通常用于檢測小分子如半抗原、激素、藥物等。樣品中待檢游離抗原與固定于固相載體上的抗原一起競爭相同的有限量抗體，當(dāng)樣品中的游離抗原越多，就可結(jié)合越多的抗體，而固相抗原只能結(jié)合較少的抗體。反之亦然。經(jīng)洗滌去除樣品中的抗原與抗體的結(jié)合物，只留下固相抗原與抗體的結(jié)合物。顯示經(jīng)計(jì)算可得樣品中抗原的含量。競爭法可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置直接法、間接法或夾心法形式。 常見問題：Elisa 實(shí)驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對試驗(yàn)的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。下面一步步分析Elisa試驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果因素。Step1: 標(biāo)本的選擇與準(zhǔn)備用于ELISA測定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清(漿)，有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前臨床上使用血清標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標(biāo)本的收集，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨46點(diǎn)之間，會有一峰值出現(xiàn)：生長激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類激素時(shí)，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí)，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的最適時(shí)間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的收集則沒有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：(1)要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。(2)樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。(3)血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在28下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時(shí)間保存，應(yīng)在-70以下。(4)冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。(5)標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。Step2: 試劑的準(zhǔn)備在臨床實(shí)驗(yàn)室，對試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置30-60分鐘，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測定要求。Step3: 加樣（1） 標(biāo)本為血清：最好將血液先自然存放1-2小時(shí)后，再用3000rmp離心15分鐘;標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時(shí)間后，3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測，可放在2-8冰箱中，若要貯存，則置于-20的低溫冰箱內(nèi)。（2）加樣后及時(shí)放入孵箱。（3）加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。（4）如果采用AT或其他全自動加樣，最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。（5）標(biāo)本較多時(shí)，請分批操作。（6）血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。Step4: 孵育（1）溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。最為常用的溫育溫度有37和室溫，其次是43和28。按照操作說明嚴(yán)格控制孵育時(shí)間；（2）孵育時(shí)貼封片或加蓋，避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁。Step5：洗板保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;反應(yīng)板過多時(shí)，合理安排，或多用幾臺洗板機(jī)，避免等待時(shí)間過長。Step6:顯色顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用; 加樣