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什么是干細胞？胚胎干細胞如何建系？多利羊是如何誕生的？怎樣利用轉基因技術制備乳腺生物反應器？動物染色體改造的方法有哪些？體細胞中的一組非同源染色體，它們在形態(tài)和功能上各不相同，但攜帶著控制一種生物生長發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個染色體組。 染色體組型是指一個體細胞中全部染色體的數目、大小和形態(tài)特征。 染色體倍性是指細胞中包含的染色體組數或基數染色體工程 按照人們需要對生物體的染色體進行操作，添加、消減或替換染色體，從而達到定向選育新品種或創(chuàng)造人工新物種的目的。是染色體水平上的細胞工程。 廣義上講它還包括染色體內部的部分遺傳操作技術。染色體工程建立在細胞遺傳學研究的基礎之上，利用已在染色體上標記的基因，應用染色體組合并、單條染色體或染色體片段的附加、代換、消除和易位等技術，按照一定的設計，有計劃、有目的地實施對生物染色體組型或染色體結構進行改造，達到最終目的。 整倍變化：多倍體：細胞中含有三個或更多染色體組的個體單倍體：細胞中含有正常體細胞的一半染色體數 非整倍體變化：染色體減少：單體（減1條）、缺體（減1對）染色體增加：三體（加1條）、四體（加1對）染色體代換：同種代換、異種代換l 體細胞內以染色體組為基數進行的整倍性變化，以整倍體染色體數目變化產生的變異會產生多倍體和單倍體；l 染色體組內的個別染色體數目有所增減，使細胞內的染色體數目不是基數的的完整倍數，因此被稱為非整倍體。n 染色體結構變異l 染色體易位：一個染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。l 染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失。l 染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉。l 染色體重復：一個染色體上增加了相同的某個區(qū)段。l 動物染色體倍性改造是指有目的、有計劃地增加或減少一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造動物新品種的一項染色體工程技術。l 主要包括多倍體育種和單倍體育種。（一） 染色體加倍的方法u 染色體加倍技術是染色體倍性改造的關鍵技術，分為自然加倍和人工誘導加倍兩種。 人工誘導加倍方法主要包括：生物學方法、化學方法、物理學方法。 物理學方法包括：溫度休克法、水靜壓法和高鹽高堿方法。 化學誘導法是利用秋水仙素和細胞松弛素B等化學物質通過抑制細胞分裂而獲得同源多倍體 生物學方法主要通過動物雜交的方法獲得異源多倍體。其中雜交主要是種間或不同種屬、科間的遠緣雜交，使得染色體加倍，也成為染色體組的合并技術。騾子就是利用這種技術生產的極有價值的生物?；瘜W誘導方法是最常用的方法之一。使用化學藥劑主要有：秋水仙素、細胞松弛素B、麻醉劑N2O等 原理：秋水仙素在一定濃度范圍內對細胞染色體復制沒有什么破壞作用，但是能夠抑制和破壞紡錘絲的形成，處理正在分裂的細胞后，使得染色體正在復制而細胞不發(fā)生分裂，從而形成同源多倍體的細胞，處理消除后，細胞可以恢復繼續(xù)分裂。多用于植物誘導，動物中容易產生嵌合體，成活率低，使用較少，只在于種間雜交相結合時使用。 細胞松弛素B是常用的動物多倍體誘導劑，通過抑制肌動蛋白聚合成微絲，阻止細胞質的分裂。在多種貝類，大西洋蛙、中華絨鰲蟹中利用。u 物理學方法包括：溫度休克法、水靜壓法和高鹽高堿方法。其中前兩種較常用，而且方法較好。 溫度休克法包括略低于致死溫度的冷休克方法（0-5）和略高于致死溫度的熱休克法（30 ） 兩種。原理：溫度休克法誘導多倍體關鍵是能否成功阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。三個制約因素：溫度處理開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）、處理溫度（T）。冷水性魚類（鮭科）用熱休克法，而溫水性魚類用冷休克法效果好。 多倍體動物多具有良好的生長率和良好的生存力。 生產上利用三倍體不育的特性，將個體生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長上，同時可以很好的抑制產卵期魚類（香魚）的死亡和肉質變差問題，不僅可以避免繁殖季節(jié)肉質下降而延誤上市時間或影響商品價值，同時也避免了生長停止和死亡率的增高，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，可以養(yǎng)成大型個體。如：美國用來提高鮑魚產量，日本培育的三倍體牙鲆。還可以培育出不育群體，以控制養(yǎng)殖密度，在昆蟲方面有應用。四倍體可育，與二倍體雜交后獲得不育的三倍體（全三倍體）很適合于水產養(yǎng)殖。轉基因動物制備的原理是什么？2.如何培育綠色熒光小鼠？需要哪些關鍵技術？3.轉基因動物制備的方法有哪些？各有哪些優(yōu)、缺點？4.如何構建動物生物反應器5.轉基因動物的前景如何？ 轉基因技術將外源DNA導入細胞的一種技術。它是在DNA重組技術的基礎上發(fā)展起來的。 轉基因動物(Transgenic animal)指借助基因工程技術將外源基因（人們需要的目的基因）導入受體動物染色體內，外源基因與動物基因整合后隨細胞分裂而擴增，在體內表達并能穩(wěn)定遺傳給后代的動物。四 制備轉基因動物的一般程序 獲取外源目的基因 外源目的基因導入細胞（生殖細胞或胚胎干細胞） 選擇攜帶目的基因的細胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物 轉基因胚胎的發(fā)育及鑒定 篩選所得的轉基因動物轉基因動物的關鍵技術 外源目的基因的制備 外源目的基因的有效導入 胚胎培養(yǎng)與移植 外源目的基因的檢測六 制備轉基因動物的方法 顯微注射法 病毒載體法 胚胎干細胞介導法 生殖細胞介導法 YAC介導法 細胞核移植法優(yōu)點： 可靠性高、重復性好，方法相對簡單，導入過程直觀； 對于小鼠來說，產生轉基因動物的效率比較高； 導入DNA片段的大小和類型不受限制； 轉基因在代與代之間傳遞的穩(wěn)定性好。缺點： 整合位點的隨意性可能對轉基因表達造成影響； 可能會出現不希望的插入突變；開發(fā)裝置和技術的花費大、時間長。（二）病毒載體法（retrovirus mediate gene transfer）細菌質粒和噬菌體載體只能將目的基因運載至細菌中擴增和表達。因此，動物病毒載體是較理想的真核基因工程載體。病毒DNA序列中有很強的啟動子，可使其后方的外源基因高產量和高頻率地表達。常用的有桿狀病毒載體、SV40載體、痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體等。技術要點 逆轉錄病毒載體的構建 包裝細胞 重組逆轉錄病毒感染早期胚胎優(yōu)點：u 逆轉錄病毒可直接感染胚胎，把外源DNA引入細胞，且轉移效率很高。u 逆轉錄病毒載體DNA沒有合成病毒蛋白的能力，所以被轉化的宿主細胞不會再產生有害的病毒顆粒，在安全的情況下，能夠合成目的基因的產物。u 利用逆轉錄病毒作為目的基因載體，通過感染早期胚胎細胞實現基因的轉移，產生嵌合體動物，在經過雜交、篩選即可獲得轉基因動物。 （三）胚胎干細胞介導法u 胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是從胚泡內細胞團分離得到的多潛能細胞。將外源基因導入體外培養(yǎng)的ES細胞，經篩選后獲得整合穩(wěn)定和表現良好的細胞，將這些細胞注射到胚泡腔中，部分ES細胞可與內細胞團融合并參與其分化，形成嵌合體。在嵌合過程中，帶有外源基因的ES細胞可能進入生殖系，再經雜交育種得到純合體，這種純合體即為所需的轉基因動物。 此方法在小鼠上應用比較成熟，大家畜比較困難。（五）YAC介導法u 技術途徑u ES細胞轉染YAC后，體外篩選陽性ES細胞并進行注射；u YAC原核注射。u 優(yōu)點u 具有克隆百萬堿基對的大片段外源DNA的能力，且保證巨大基因的完整性；u 整合效率提高；u 保證了順式元件的完整性與結構基因的位置關系不變；u 可以消除基因整合后的“位置效應”。u 生物反應器的發(fā)展階段細菌基因工程、細胞基因工程、轉基因動物生物反應器。u 生物反應器選擇的器官和組織為方便產物的獲取，產生了動物乳腺反應器，動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器。u 乳腺生物反應器（mammary gland bioreactor)利用哺乳動物乳腺特異性表達的啟動子元件構建轉基因動物，指導外源基因在乳腺中表達，并從轉基因動物的乳液中獲取重組蛋白。 表達載體的構建 目的基因的選擇 體外重組 基因的轉移 制備轉基因動物鑒定 產品質量穩(wěn)定 產品成本低 研制開發(fā)周期短 無污染 經濟效益顯著乳腺生物反應器應用 改良乳汁品質 生產藥用蛋白 1.什么是轉基因動物 2.轉基因動物培育的基本原理及一般程序 3.轉基因動物制備的關鍵技術 4.制備轉基因動物的主要方法及優(yōu)缺點 5.轉基因動物的應用及面臨的問題 6.乳腺生物反應器的制備 7.乳腺生物反應器的應用一 多利羊的培育過程二 核移植的概念、分類和原理三 核移植技術的操作程序一 多利是如何誕生的？二 什么是核移植？有哪些種類？三 核移植技術包括哪些步驟？干細胞: 干細胞是一種具有自我更新和分化潛能的細胞。u 胚胎干細胞（embryonic stem cell,ES細胞）：指從著床前的內細胞團或原始生殖細胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細胞、同時可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長的克隆細胞系。u 成體干細胞(adult stem cell)：在成體組織內具有自我更新能力及能分化成一種或一種以上子細胞的未成熟細胞。 全能性干細胞（totipotent stem cell） 具有形成完整個體的分化潛能。如：胚胎干細胞。 多能性干細胞（multipotent stem cell） 具有分化出多種細胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。如：骨髓多能造血干細胞可分化出至少12種血細胞。 單能干細胞（committed stem cell） 是一種定向干細胞，又稱專能干細胞、偏能干細胞，只能向一種類型或密切相關的兩種類型的細胞分化。 胚胎干細胞的發(fā)育等級較高，是全能干細胞，而成體干細胞的發(fā)育等級較低，屬多能或單能干細胞。其中，胚胎干細胞包括ES細胞、EC細胞和EG細胞，成體干細胞種類較多。胚胎干細胞和成體干細胞的區(qū)別胚胎干細胞 成體干細胞 來源 早期胚胎 胎兒或成體 細胞增殖能力 無限 有限 分化潛能 全能 有限 免疫排斥性 有排斥性 自體移植無排斥性 生物學功能 能分化成具有生理功能的細胞 能分化成具有生理功能的細胞倫理問題 存在 不存在 轉分化(transdifferentiation) 一種組織類型的干細胞在適當條件下可以分化為另一種組織類型的細胞。 去分化(dedifferentiation) 一種干細胞向其前體細胞的逆向轉化。四 ES細胞的建系 分離材料的獲取及處理 早期胚胎的獲取及處理方法 原生殖細胞的獲取 分化抑制 分化抑制物質的選擇 飼養(yǎng)層、條件培養(yǎng)基和分化抑制因子 基礎培養(yǎng)基的選擇 添加物質的選用 培養(yǎng)后分離傳代 干細胞的定義、特點和分類 胚胎干細胞的建系 ES與成體干細胞的區(qū)別 組織工程的定義和應用 什么是ES？分為哪些種類？有什么特點？ ES和成體干細胞有什么區(qū)別？ ES的建系包括哪些步驟？ 什么是組織工程？有哪些應用？ 簡述超數排卵的基本方法及其意義。 比較幾種胚胎保存技術的優(yōu)缺點。 簡述胚胎移植的主要操作過程(以牛為例)。 簡述X、Y精子常用的分離方法及其原理。 性別控制在生產實踐中有何意義？性別控制的意義 1.在臨床上通過性別控制可以避免一些與性別相關疾病的發(fā)生。 2.在畜牧業(yè)生產中通過性別控制生產所需要的后代，可以提高畜牧業(yè)生產的經濟效益。 3.在動物育種過程中通過性別控制可以加快育種進程。 為了一次獲得多個卵，利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數排卵（superovulation） 1. 細胞融合的方