十體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗

118 十 體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗十 體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 1 范圍范圍 本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳類細(xì)胞基因突變試驗的基本原則 要求和方法 本規(guī)范適用于檢測化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性 2 規(guī)范性引用文件規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals No 476 1997 3 試驗?zāi)康脑囼災(zāi)康?該測試系統(tǒng)用于檢測化妝品原料及其產(chǎn)品引起的突變 包括堿基對突變 移碼突變和缺 失等 從而評價受試物引起突變的可能性 4 定義定義 正向突變 Forward mutation 從原型至突變子型的基因突變 這種突變可引起酶和功 能蛋白的改變 突變頻率 Mutant frequency 所觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)之比值 5試驗原理試驗原理 在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下 使細(xì)胞暴露于受試物一定時間 然后將細(xì)胞再 傳代培養(yǎng) 突變細(xì)胞在含有 6 硫代鳥嘌呤 6 thioguanine 6 TG 或三氟胸苷 trifluorothymidine TFT 的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落 基于突變集落數(shù) 計 算突變頻率以評價受試物的致突變性 6 試驗方法試驗方法 6 1 試劑和受試物制備 6 1 1 受試物 6 1 1 1 受試物的配制 固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中 用前稀釋至適合濃度 液體受 試物可以直接加入試驗系統(tǒng) 或用前稀釋至適合濃度 受試物應(yīng)在使用前新鮮配制 否則就必 須證實儲存不影響其穩(wěn)定性 6 1 1 2 溶劑的選擇 溶劑必須是非致突變物 不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 不影響細(xì)胞存活 和 S9 活性 首選溶劑是水或水溶性溶劑 二甲基亞砜 DMSO 也是常用溶劑 但使用時濃 度不應(yīng)大于 0 5 6 1 1 3 受試物濃度設(shè)置 6 1 1 3 1 最高濃度的選擇 決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性 受試物在試驗系統(tǒng)中的溶解 度以及 pH 或滲克分子濃度 osmolality 的改變 6 1 1 3 2 細(xì)胞毒性的確定 應(yīng)使用指示細(xì)胞完整性和生長情況的指標(biāo) 在活化系統(tǒng)存在或 不存在兩種條件下確定細(xì)胞毒性 例如相對集落形成率或相對細(xì)胞總生長情況 total growth 應(yīng)在預(yù)試驗中確定細(xì)胞毒性和溶解度 6 1 1 3 3 劑量設(shè)置 119 至少應(yīng)設(shè)置 4 個可供分析的濃度 當(dāng)有細(xì)胞毒性時 其濃度范圍應(yīng)包括從最大毒性至幾 乎無毒性 通常濃度間隔系數(shù)不大于 10 如最高濃度是基于細(xì)胞毒性 那么該濃度組的細(xì)胞相對存活率 相對集落形成率 或相 對細(xì)胞總生長情況應(yīng)為 10 20 不低于 10 對于那些細(xì)胞毒性很低的化合物 最高濃度應(yīng)是 5 L mL 5mg mL 或 0 0lmol L 對于相對不溶解的物質(zhì) 其最高濃度應(yīng)達(dá)到或超過在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下的溶解度限值 最 好在試驗處理開始和結(jié)束時均評價溶解度 因為由于 S9等的存在 試驗系統(tǒng)內(nèi)在暴露過程中 溶解度可能發(fā)生變化 不溶解性可用肉眼鑒別 但沉淀不應(yīng)影響觀察 6 1 2 對照 在每一項試驗中 在代謝活化系統(tǒng)存在和不存在的條件下均應(yīng)設(shè)陽性對照和陰 性 溶劑 對照 6 1 2 1 陽性對照 當(dāng)使用代謝活化系統(tǒng)時 陽性對照物必須是要求代謝活化 并能引起突 變的物質(zhì) 在沒有代謝活化系統(tǒng)時 陽性對照物可使用甲磺酸乙酯 ethyl methanesulfonate EMS 甲磺酸甲酯 methyl methanesulphonate MMS 乙基亞硝基脲 ethyl nitrosourea ENU 等 在有代謝活化系統(tǒng)時 可以使用 3 甲基膽蒽 3 methylcholanthrene 環(huán)磷酰胺 cyclophosphamide N 亞硝基胍 N nitroso dimethylamine 7 12 二甲基苯蒽等 也可使用 其他適宜的陽性對照物 6 1 2 2 陰性對照物 陰性對照 包括溶劑對照 除不含受試物外 其他處理應(yīng)與受試物相 同 此外 當(dāng)不具有實驗室歷史資料證實所用溶劑無致突變作用和無其他有害作用時 還應(yīng) 設(shè)空白對照 6 1 3 細(xì)胞 HPRT 位點(diǎn)突變分析常用中國倉鼠肺細(xì)胞株 V 79 和中國倉鼠卵巢細(xì)胞株 CHO TK 位點(diǎn)突變分析常用小鼠淋巴瘤細(xì)胞株 L5178Y 和人類淋巴母細(xì)胞株 TK6 6 1 4 培養(yǎng)液 應(yīng)根據(jù)實驗所用系統(tǒng)和細(xì)胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基 對于 V 79 或 CHO 細(xì) 胞 常用 MEM Eagle 培養(yǎng)基加入 10 胎牛血清和適量抗菌素 對于 L5178Y 或 TK6 細(xì)胞 常用 RPMI 1640 培養(yǎng)基加入 10 馬血清和適量抗菌素 6 1 5 活化系統(tǒng) 同體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗 6 1 6 選擇劑 6 硫代鳥嘌呤 6 TG 建議使用終濃度為 5mg mL 三氟胸苷 TFT 建 議使用終濃度為 3mg mL 6 2 試驗步驟 6 2 1 HPRT 位點(diǎn)突變分析 6 2 1 1 試驗前 1d 接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中 置于 37 C 孵箱培養(yǎng) 6 2 1 2 試驗時吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 加入一定濃度的受試物 S9 mix 不加入 S9 mix 的 樣品 用培養(yǎng)液補(bǔ)足 及一定量的不含血清培養(yǎng)液 置孵箱中處理 3h 6h 后 吸去培養(yǎng)液 用 Hank s 液洗細(xì)胞三次 加入含胎牛血清的培養(yǎng)液 6 2 1 3 在受試物與細(xì)胞作用后當(dāng)天和第 3d 將細(xì)胞按低密度分種 在第 7d 接種細(xì)胞 每個 劑量 3 瓶 7d 后染色以測定細(xì)胞存活率 另將一定數(shù)量細(xì)胞接種于每個培養(yǎng)瓶中 每個劑 量 8 瓶 3h 后加入 6 TG 終濃度為 5mg mL 10d 后染色 計數(shù)突變細(xì)胞集落 6 2 1 4 試驗結(jié)果用 x 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析 6 2 2 TK 位點(diǎn)突變分析 L5178Y 細(xì)胞 96 孔板法 6 2 2 1 處理 取生長良好的細(xì)胞 調(diào)整密度為 5 105 mL 按 1 體積加入受試物 37 震 搖處理 3 小時 離心 棄上清液 用 PBS 或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 遍 重新懸浮細(xì)胞 于含 10 馬血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中 并調(diào)整細(xì)胞密度為 2 105 mL 120 6 2 2 2 PE0 0 天的平板接種效率 測定 取適量細(xì)胞懸液 作梯度稀釋至 8 個細(xì)胞 mL 接種 96 孔板 每孔加 0 2 mL 即平均 1 6 個細(xì)胞 孔 每個劑量作 1 2 塊板 37 5 CO2 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12d 計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù) 6 2 2 3 表達(dá) 步驟 6 2 2 1 所得細(xì)胞懸液作 2d 表達(dá)培養(yǎng) 每天計數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在 106 ml 以下 6 2 2 4 PE2 第 2d 的平板接種效率 測定 第 2d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后 取適量細(xì)胞懸液 按步 驟 6 2 2 2 作梯度稀釋并接種 96 孔板 培養(yǎng) 12d 后計數(shù)每塊平板有集落生長的孔數(shù) 6 2 2 5 TFT 抗性突變頻率 MF 測定 第 2d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后 取適量細(xì)胞懸液 調(diào)整細(xì) 胞密度為 1 104 mL 加入 TFT 三氟胸苷 終濃度為 3 g mL 混勻 接種 96 孔板 每孔 加 0 2 mL 即平均 2000 個細(xì)胞 孔 每個劑量作 2 4 塊板 37 5 CO2 飽和濕度條件 下培養(yǎng) 12d 計數(shù)有突變集落生長的孔數(shù) 6 2 2 6 計算 6 2 2 6 1 平板效率 PE0 和 PE2 ln EW TW PE 1 6 式中 EW 為無集落生長的孔數(shù) TW 為總孔數(shù) 1 6 為每孔接種細(xì)胞數(shù) 6 2 2 6 2 相對存活率 RS PE0 處理 相對存活率 RS PE0 對照 100 6 2 2 6 3 突變頻率 MF ln EW TW n MF 10 6 PE2 式中 EW 為無集落生長的孔數(shù) TW 為總孔數(shù) n 為每孔接種細(xì)胞數(shù) 2000 7 結(jié)果評價結(jié)果評價 在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中為陽性結(jié)果 1 受試物引起突變頻率具有統(tǒng)計學(xué)意義 并與劑量相關(guān)的增加 2 受試物在任何一個劑量條件下 引起具有統(tǒng)計學(xué)意義 并有可重復(fù)性的陽性反應(yīng) 陰性結(jié)果的判定需在 RS 達(dá) 20 即已產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性 的情況下未見突變頻率顯 著增加時方可作出 在評價時應(yīng)把生物學(xué)和統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)合考慮 陽性結(jié)果表明受試物可引起所用哺乳類細(xì)胞的基因突變 可重復(fù)的陽性劑量 反應(yīng)關(guān)系 意義更大 陰性結(jié)果表明在本試驗條件下 受試物不引起所用哺乳類細(xì)胞的基因突變 8 試驗報告試驗報告 試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容 1 受試物名稱 有關(guān)的理化性狀 所用溶劑及其配制 劑量選擇 應(yīng)說明受試物對細(xì) 胞毒性的測定方法 溶解情況等 2 細(xì)胞株名稱 3 實驗條件和方法 代謝活化系統(tǒng) 制備 S 時所用的誘導(dǎo)劑 動物品種和來源 S mix 的配方 對照物 陽性對照物名稱和使用濃度 陰性 溶劑 對照物名稱及使用濃度 培養(yǎng)液 所用培養(yǎng)液名稱 血清類別和使用濃度