第八章消化系統(tǒng)疾病動物模型.ppt

2020 3 31 1 第八章消化系統(tǒng)疾病動物模型 Theanimalmodelsofdigestivessystemdiseases 第一節(jié)急性胃炎動物模型 急性胃炎動物模型 2020 3 31 3 Wistar大鼠 雄性 300g 實驗動物 一 酸制劑誘發(fā)急性胃炎模型 急性胃炎動物模型 大鼠禁食24h 在清醒狀態(tài)下 用下述試劑或物質(zhì)灌胃 1 水楊酸制劑 如20mmol L阿司匹林或水楊酸溶液 按100mg kg體重灌胃 2 2ml10mmol L的醋酸或2ml不同濃度的鹽酸 1 10 100mmol L 3 2ml同種動物膽汁或2mmol L的?；悄懰?4 15 的乙醇 2 4 可單獨或幾種合用 2ml左右 灌胃 操作方法 急性胃炎動物模型 4h后處死動物 剖檢可見胃內(nèi)發(fā)生急性彌漫性炎癥改變 胃粘膜表面有淺表糜爛 出血 粘膜層內(nèi)見中性粒細胞浸潤 結(jié)果 病變 急性胃炎動物模型 2020 3 31 6 堿性腸液倒流入胃 刺激胃粘膜可引起炎癥 即膽汁反流性胃炎 常見于原發(fā)性或繼發(fā)性幽門功能紊亂或胃切除術(shù)后 本法取上部小腸的堿性腸液注入已結(jié)扎幽門的同種大鼠胃內(nèi) 使之對胃粘膜產(chǎn)生持續(xù)刺激 形成胃炎 造模原理 二 膽汁返流性胃炎模型 急性胃炎動物模型 2020 3 31 7 Wistar大鼠 雄性 180 220g 實驗動物 二 膽汁返流性胃炎模型 急性胃炎動物模型 2020 3 31 8 1 制備上部小腸液 2 向胃內(nèi)注入小腸液 2ml 只 正常對照組注入2ml生理鹽水 縫合腹壁 腹腔注射阿托品5mg kg體重 以抑制胃液分泌 利于胃粘膜損傷模型的形成 3 處死大鼠 開腹 結(jié)扎賁門 取出胃 沿胃大彎剪開 用濾紙吸干表面水分 立即稱量胃重 以胃濕重 體重之比 胃系數(shù) 表示胃水腫程度 4 肉眼觀察并計數(shù)整個胃粘膜出血點數(shù) 作為損傷指數(shù) 操作方法 急性胃炎動物模型 2020 3 31 9 模型組動物胃系數(shù)和損傷指數(shù)明顯增加 肉眼觀察模型組胃粘膜充血 水腫 皺襞減少 顏色暗紅 并有大量散在出血點 結(jié)果 急性胃炎動物模型 2020 3 31 10 第二節(jié)慢性胃炎動物模型 2020 3 31 11 三 大鼠慢性萎縮性胃炎模型 病因 酗酒 用藥不當(dāng) 飲食習(xí)慣不良 幽門螺桿菌感染 自身免疫 造模評價 組織病理學(xué)是評價造模成功的最主要指標 主要觀察和測量胃粘膜厚度 粘膜肌層厚度 腺體數(shù)量 壁細胞數(shù)量 固有層炎細胞浸潤程度和腸化生發(fā)生率等 2020 3 31 12 造模方法 綜合法一膽汁 去氧膽酸鈉 熱水 主動免疫綜合法二去氧膽酸鈉 熱糊 主動免疫綜合法三去氧膽酸鈉 酒精 氨水 吲哚美鋅氨水單因素法 2020 3 31 13 綜合法復(fù)制伴有幽門螺桿菌感染的慢性萎縮性胃炎模型 飲用去氧膽酸鈉水 免疫損傷 飲寒涼膽汁 飲食不潔和 或肌飽失常 HP灌胃 2020 3 31 14 第三節(jié)急性胃潰瘍動物模型 2020 3 31 15 潰瘍病的病因 致潰瘍因素 胃酸 胃蛋白酶 非甾體抗炎藥不合理應(yīng)用 幽門螺桿菌感染等 防御因素 粘液 碳酸氫鹽屏障 粘膜屏障 粘膜血流量 胃上皮細胞的更新 表皮生長因子和內(nèi)生性前列腺素等 潰瘍的形成主要由于防御因素和致潰瘍因素的平衡失調(diào)所致 2020 3 31 16 應(yīng)激法 幽門結(jié)扎法 藥物法 醋酸法 常用的方法 急性胃潰瘍動物模型 在抗?jié)兯幬锼幮W(xué)試驗中 水浸應(yīng)激法 幽門結(jié)扎法和醋酸法制備的胃潰瘍模型為必做實驗 利血平法和乙醇法可任選其一 乙醇組胺促胃液素腎上腺類固醇水楊酸鹽血清素利血平保泰松等 一 應(yīng)激性胃潰瘍模型 應(yīng)激性胃潰瘍模型 應(yīng)激刺激 造模機制 血管收縮 胃運動亢進 副交感神經(jīng) 垂體 腎上腺系統(tǒng)興奮性 應(yīng)激性潰瘍 胃酸 胃蛋白酶和胃泌素分泌 胃粘膜缺血 缺氧和抵抗力 交感神經(jīng)興奮性 應(yīng)激性胃潰瘍模型 Wistar大鼠 160 180g 雌雄不限 實驗動物 器材 大鼠固定鋼板或束縛籠 恒溫水浴裝置 應(yīng)激性胃潰瘍模型 2020 3 31 20 應(yīng)激束縛籠 應(yīng)激性胃潰瘍模型 2020 3 31 21 禁食 不禁水 24h 將動物固定 籠或固定器 垂直浸于18 20 的恒溫水浴槽中 水面浸至劍突水平 水浸泡7h后取出 處死動物 立即開腹檢查 胃的固定及處理 操作方法 應(yīng)激性胃潰瘍模型 2020 3 31 22 水浸3h 胃粘膜即發(fā)生損傷 7 8h胃粘膜可出現(xiàn)多發(fā)性 出血性糜爛小點 20h胃粘膜病變相當(dāng)嚴重 但潰瘍改變不超過粘膜肌層 且以 腺胃 含胃體和胃竇 為重 應(yīng)激性潰瘍在腺胃部沿血管走行分布 表面覆蓋凝血塊 去除凝血后可見深褐色條索狀潰瘍 結(jié)果 應(yīng)激性胃潰瘍模型 2020 3 31 23 長度 寬度 點數(shù) 潰瘍程度的評定 應(yīng)激性胃潰瘍模型 1 潰瘍指數(shù) 潰瘍的長徑大于lmm者 直接測量其長度 每lmm為1分 寬度大于lmm 則計分加倍長度和寬度都小于lmm 按潰瘍點數(shù)計 每點計0 5分 將每只動物的累計總分作為該動物的潰瘍指數(shù) 在組間進行比較 2020 3 31 24 記分 潰瘍程度的評定 應(yīng)激性胃潰瘍模型 1 潰瘍指數(shù) 點狀淤血為1分 線狀淤血 長度小于1mm為2分 1 2mm為3分 3 4mm為4分 大于5mm為5分 將全胃分數(shù)的總和作為該大鼠的潰瘍指數(shù) 2020 3 31 25 模型組潰瘍指數(shù) 給藥組潰瘍指數(shù)潰瘍抑制百分率 100 模型組潰瘍指數(shù) 潰瘍程度的評定 應(yīng)激性胃潰瘍模型 根據(jù)潰瘍指數(shù)推算 發(fā)生潰瘍的動物數(shù)潰瘍發(fā)生百分率 100 實驗動物數(shù) 2020 3 31 26 胃潰瘍發(fā)生率高 重復(fù)性較好 中樞抑制劑 抗膽堿藥 制酸藥對其有明顯對抗作用 方法簡單 結(jié)果可靠 迄今仍是研究抗?jié)兯幬锏某Ｓ媚Ｐ?水溫應(yīng)保持恒定 動物禁食期間 如自食糞便會影響實驗結(jié)果 模型評價與注意事項 應(yīng)激性胃潰瘍模型 2020 3 31 27 應(yīng)激束縛籠的大小應(yīng)與動物匹配 松緊度合適 雌性大鼠更易引起應(yīng)激性潰瘍 受試藥物一般在應(yīng)激前30 60min給予 雷尼替丁0 135g kg西咪替丁 甲氰咪胍 1 0g kg體重 模型評價與注意事項 應(yīng)激性胃潰瘍模型 二 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 通過手術(shù)結(jié)扎幽門 使胃內(nèi)胃酸 胃蛋白酶潴留 對胃粘膜造成侵蝕而形成潰瘍 成年大鼠 雄雌均可 造模機制 實驗動物 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 30 1 給藥3天 實驗前大鼠禁食 24h 不禁水 2 自胸骨劍突下沿腹中線切開腹壁 切口約2 3cm 在左側(cè)肋緣部位用手指輕輕上推暴露胃 3 在胃幽門下穿結(jié)扎線 勿傷及血管 將幽門結(jié)扎 注意勿將鄰近的其他器官 血管結(jié)扎 同時經(jīng)十二指腸給予受試藥 縫合腹壁切口 用紗布包扎切口 操作方法 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 31 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 32 4 幽門結(jié)扎后 停止供水供食 術(shù)后18h處死大鼠 取胃固定 剖檢 5 沿胃大彎剪開胃壁 洗凈胃內(nèi)容物 將胃壁展開 胃粘膜面向上用大頭釘固定在蠟板上 6 用肉眼或放大鏡觀察胃粘膜面 記錄每只動物產(chǎn)生的潰瘍數(shù) 潰瘍程度 潰瘍面積 或潰瘍指數(shù) 及病變的情況 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 33 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 34 結(jié)果 形成的潰瘍主要發(fā)生在對胃液抵抗力較弱的前胃部 瘤胃 多為圓形或橢圓形 但病變較表淺 屬于胃粘膜急性出血性糜爛 與人類胃潰瘍的典型病變差距較大 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 35 病變評價 1 潰瘍面積通過潰瘍中心量取的最大縱徑和橫徑S d1 2 d2 2 式中S為潰瘍面積 d1為通過潰瘍中心量取的最大縱徑 d2為通過潰瘍中心量取的最大橫徑 可計數(shù) 前胃部潰瘍面積 以其總和作為潰瘍指數(shù) 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 36 病變評價 2 潰瘍程度 Okabe法 在解剖顯微鏡下測量潰瘍面積 將每只鼠潰瘍面積的綜合分為5個等級作為潰瘍指數(shù) 潰瘍面積總和 mm2 1 1213 2526 3738 50 50mm2或穿孔潰瘍指數(shù) 1級2級3級4級5級 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 37 病變評價 根據(jù)潰瘍指數(shù)可進一步計算 潰瘍抑制百分率 100 潰瘍發(fā)生百分率 100 對照組潰瘍指數(shù) 給藥組潰瘍指數(shù) 對照組潰瘍指數(shù) 形成潰瘍動物數(shù) 實驗動物數(shù) 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 38 造模方法簡單 潰瘍發(fā)生快 成功率可達85 100 用于觀察藥物對潰瘍形成的預(yù)防作用 本法規(guī)定大鼠禁食48 72h 如大鼠體重小于180g 禁食24 48h 這樣動物可以耐受手術(shù) 若大鼠體重超過180g 禁食48 72h 可提高胃潰瘍發(fā)生率 在實驗過程中 大鼠單籠飼養(yǎng) 籠底網(wǎng)眼應(yīng)足以使糞便容易漏下 防止動物因自食糞便而影響潰瘍形成 評價和注意事項 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 2020 3 31 39 在幽門結(jié)扎時 勿影響胃壁血管 勿牽扯幽門和用器械鉗夾胃壁 干擾實驗結(jié)果 結(jié)扎時間的長短 室溫可直接影響潰瘍的形成 觀察藥物對潰瘍的影響時 動物應(yīng)預(yù)先給藥或同時給藥 若粗制劑可采用灌胃給藥 應(yīng)確認胃內(nèi)藥物已排空后方能結(jié)扎幽門 粗制劑可在結(jié)扎幽門的同時采用十二指腸內(nèi)注入給藥較好 給藥方法也可以連續(xù)給藥5d 每天1次 第3天給藥后開始禁食 末次給藥后3h手術(shù)結(jié)扎幽門 評價和注意事項 幽門結(jié)扎法胃潰瘍模型 三 乙醇誘發(fā)胃損傷模型 急性胃潰瘍 乙醇法 2020 3 31 41 1 破壞胃粘膜屏障的完整性減少胃粘膜中前列腺素 氨基己糖含量 降低胃粘膜血流量 減小胃粘膜跨膜電位差 破壞主細胞減少粘液分泌 引起胃粘膜微循環(huán)障礙等 2 細胞內(nèi)鈣超載和細胞凋亡 急性胃潰瘍 乙醇法 造模機制 成年大鼠 性別不拘 大鼠禁食不禁水24h 最后1次給予受試藥 給藥體積為1 0ml 100g體重 后3h 灌服無水乙醇1ml 只 1h后開腹取胃 以10 甲醛液胃腔內(nèi)固定后檢查胃粘膜損傷程度 評價損傷程度以各組動物的潰瘍指數(shù)進行組間比較 陽性對照藥可選用雷尼替丁 劑量0 135g kg體重 灌胃給予 急性胃潰瘍 乙醇法 實驗動物 操作步驟 2020 3 31 43 15分鐘即可造成明顯的胃粘膜損傷 且時間越長損傷越嚴重 損傷主要發(fā)生在 腺胃部表現(xiàn)為粘膜充血 水腫 細胞壞死 伴有糜爛 出血及縱行的條索狀出血壞死 急性胃潰瘍 乙醇法 結(jié)果 2020 3 31 44 乙醇性胃潰瘍的程度與乙醇的濃度成正比 一般乙醇濃度40 以上可引起胃黏膜明顯損傷 80 以上時出現(xiàn)明顯破潰 壞死 因此制備胃潰瘍模型時多采用75 以上乙醇或無水乙醇 也可用鹽酸 乙醇 50 乙醇 O 15mmol L鹽酸 給大鼠灌胃 1ml 100mg 造成潰瘍 稱為酸乙醇性潰瘍 急性胃潰瘍 乙醇法 模型評價及注意事項 四 利血平誘發(fā)胃潰瘍模型 急性胃潰瘍 利血平法 2020 3 31 46 利血平是外周交感神經(jīng)阻滯藥 能耗竭腎上腺素能神經(jīng)末梢內(nèi)兒茶酚胺類遞質(zhì) 引起胃粘膜損傷 可減弱腎上腺素能神經(jīng)的功能 使迷走神經(jīng)興奮性相對升高 胃酸分泌增加 胃及血管平滑肌收縮加強 可耗竭中樞及外周神經(jīng)以及其他組織的多巴胺 使多巴胺的細胞保護作用減弱 可減少胃粘膜NO含量 降低胃粘膜的抗損傷能力 從而引起胃潰瘍 急性胃潰瘍 利血平法 造模機制 成年小鼠 雄雌均可 動物禁食不禁水24h后 灌胃給予受試藥后1h 腹腔注射利血平5mg kg體重 18h后處死動物 取胃按上述方法用10 甲醛液固定 沿胃大彎剪開胃 平鋪于白紙上 觀察潰瘍發(fā)生情況 急性胃潰瘍 利血平法 實驗動物 操作步驟 2020 3 31 48 損傷主要發(fā)生在腺胃部 可呈現(xiàn)條索狀出血點 瘀血斑或糜爛灶 利血平的劑量不宜過大 否則動物容易死亡 給利血平后處死動物的最佳時間 可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定 該模型的穩(wěn)定性與動物體質(zhì) 禁食時間 利血平劑量 室溫等因素有關(guān) 應(yīng)盡量控制實驗條件一致 陽性藥對照可以選用雷尼替丁0 135g kg體重 或西咪替丁 甲氰咪胍 1 0g kg體重 均灌胃給予 急性胃潰瘍 利血平法 結(jié)果及評價 2020 3 31 49 五 吲哚美辛誘發(fā)胃潰瘍模型 急性胃潰瘍 利血平法 2020 3 31 50 造模原理 環(huán)氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶 前列腺素E通過增加粘液和碳酸氫鹽分泌 促進粘膜血流增加 細胞保護等機制 在維持胃粘膜防御和修復(fù)功能中起重要作用 環(huán)氧合酶受抑制 可使胃粘膜生理性前列腺素E合成減少 大劑量吲哚美辛顯著抑制環(huán)氧合酶活性 致使胃粘膜防御因素減弱而形成潰瘍 實驗動物 體重160 180g大鼠 雌雄各半 操作方法 大鼠禁食不禁水24h 皮下注射吲哚美辛20 30mg kg體重 7h后處死動物 觀察潰瘍情況并測量潰瘍指數(shù) 潰瘍主要位于腺胃部 表現(xiàn)為與長軸平行的線狀 點狀淤血 陽性對照藥可選雷尼替丁 灌胃給予 吲哚美辛粉用5 碳酸氫鈉溶液配 10mg ml 再用蒸餾水稀釋成2mg ml 此溶液為等張 pH 7 5 8 0 2020 3 31 52 模型評價與注意事項 本模型胃潰瘍發(fā)生率高 重復(fù)性好 缺點是潰瘍比較表淺 胃損傷程度與動物體質(zhì) 禁食時間 吲哚美辛劑量 給予后的時間等有關(guān) 觀察藥物的抗?jié)冃Ч话銘?yīng)預(yù)先給藥 給藥后30 60min再給吲哚美辛 可采用阿司匹林口服或腹腔注射 150mg kg體重 復(fù)制類似的胃潰瘍模型 2020 3 31 53 第四節(jié)慢性胃潰瘍動物模型 慢性胃潰瘍動物模型 一 醋酸誘發(fā)慢性胃潰瘍模型 慢性胃潰瘍動物模型 在大鼠胃漿膜面浸漬或在漿膜下注射一定量的醋酸 由于醋酸的腐蝕作用使胃粘膜損傷而造成潰瘍 潰瘍呈圓形或卵圓形 深?？衫奂拔副诟鲗?造成穿透性潰瘍 潰瘍的形狀 部位及組織學(xué)上胃壁組織的壞死和修復(fù)情況均與人類潰瘍類似 潰瘍愈合過程緩慢 常出現(xiàn)反復(fù) 是一種慢性頑固性潰瘍 該潰瘍模型多用于研究藥物對慢性潰瘍愈合過程的影響 成年大鼠 性別不限 慢性胃潰瘍動物模型 造模機制 實驗動物 2020 3 31 56 1 胃粘膜注射法2 胃漿膜浸蝕法 慢性胃潰瘍動物模型 操作方法 2020 3 31 57 1 胃粘膜注射法大鼠禁食24h 自由飲水 乙醚麻醉 常規(guī)消毒開腹 暴露胃 在腺胃部前壁的竇體交界處 用小號注射針在漿膜下注入30 醋酸0 03ml 然后緩慢出針 勿使醋酸溢出 用生理鹽水清洗胃壁創(chuàng)面 將胃送回腹腔 縫合腹壁創(chuàng)口 手術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng) 術(shù)后24h按體重隨機分組 模型組灌胃給予蒸餾水 給藥組給予不同劑量受試藥物 每天1次 連續(xù)給予10d 術(shù)后第11天處死動物 剖腹 結(jié)扎幽門及賁門 胃內(nèi)注入10 甲醛液10ml 將胃放入同一濃度甲醛液中再固定10min 使胃的內(nèi)外層固定以便測量 慢性胃潰瘍動物模型 操作方法 2020 3 31 58 2 胃漿膜浸蝕法用直徑5 5m的圓形濾紙片蘸滿冰醋酸 貼在腺胃部前壁漿膜面30s 同法重復(fù)1次 然后用適量生理鹽水清洗掉冰醋酸 將胃送回腹腔 縫合腹壁創(chuàng)口 也可在腺胃部前壁的竇體交界處將內(nèi)直徑5mm 長30mm的玻璃管垂直放置于漿膜面上 向管腔內(nèi)加入冰醋酸0 2ml 使其接觸漿膜面1 5min 然后用生理鹽水棉簽蘸去冰醋酸 慢性胃潰瘍動物模型 操作方法 2020 3 31 59 術(shù)后3 5d可形成潰瘍 潰瘍一般呈圓形 卵圓形或不規(guī)則形 中心凹陷 四周微隆起 密布毛細血管 已愈合的潰瘍 周圍稍有隆起 表面紅潤 可見愈合的痕跡 一般術(shù)后第5日潰瘍形成最為嚴重 以后緩慢愈合 但病變有反復(fù) 直徑6mm以下的潰瘍40天可完全愈合 大的潰瘍可殘留80 200天 慢性胃潰瘍動物模型 病變 大鼠慢性胃潰瘍模型 慢性胃潰瘍模型 2020 3 31 62 成功率高 重現(xiàn)性好 潰瘍深而大 與人類的慢性潰瘍極為相似 因而可作為篩選治療慢性胃潰瘍藥物的實驗?zāi)Ｐ?一般促進粘膜修復(fù)藥 抗胃蛋白酶藥對醋酸性潰瘍有明顯的促進愈合作用 制酸藥 抗膽堿藥也具有促進潰瘍愈合效果 慢性胃潰瘍動物模型 評價和注意事項 2020 3 31 63 操作過程應(yīng)嚴格消毒 籠具也應(yīng)消毒 以免術(shù)后感染影響藥物的觀察治療 注射的部位要求一致 必需將醋酸注入到漿膜下 切勿穿透粘膜注入胃腔內(nèi) 發(fā)現(xiàn)有誤者應(yīng)棄去以免影響結(jié)果 潰瘍灶的大小與注射醋酸的量有關(guān) 醋酸的量要準確 否則形成的潰瘍差異較大 慢性胃潰瘍動物模型 評價和注意事項 2020 3 31 64 二 幽門螺桿菌感染性胃潰瘍模型 慢性胃潰瘍動物模型 2020 3 31 65 造模原理 Hp含有大量尿素酶 能迅速分解食物中尿素產(chǎn)生氨 氨中和胃酸使局部pH值增高 使細菌不被胃酸殺滅 Hp能分泌產(chǎn)生細胞毒素 引起細胞損傷 使細胞空泡化 導(dǎo)致胃粘膜完整性破壞 從而形成胃炎及胃 十二指腸潰瘍 單純給動物灌服一定量的Hp菌液 只能在感染動物的胃粘膜造成炎癥反應(yīng) 很少引起胃粘膜破損 潰瘍 因此 多在動物胃潰瘍模型的基礎(chǔ)上 使動物感染Hp 常用動物有小鼠 大鼠 沙土鼠等 2020 3 31 66 操作方法 BALB c小鼠 在胃大彎竇部粘膜掛上帶有腐蝕性藥物的棉線 造成胃潰瘍 在此基礎(chǔ)上感染幽門螺桿菌 加重病變程度 SD大鼠 先用熱烙法復(fù)制胃潰瘍 在此基礎(chǔ)上灌胃給予Hp菌液 沙土鼠 動物禁食禁水1d 第2天灌胃給予50 乙醇0 3ml 之后繼續(xù)禁食禁水 第2天灌胃給予HP菌液上 下午各1次 隔日上午再灌胃給予菌液1次 2020 3 31 67 第五節(jié)急性和慢性肝損傷動物模型 2020 3 31 68 常用的肝損傷物質(zhì) 四氯化碳D 半乳糖胺硫代乙酰胺刀豆蛋白A 2020 3 31 69 一 四氯化碳急性肝損傷模型 2020 3 31 70 CCl4是無色透明液體 不溶于水 在肝內(nèi)CCl4經(jīng)NADPH和肝微粒體細胞色素P450混合功能氧化酶的作用 生成活潑的三氯甲基自由基 CCl3 和氯自由基 這些自由基能與細胞內(nèi)和細胞膜上大分子發(fā)生共價結(jié)合 引起富含不飽和脂肪酸的生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化 導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞 肝細胞損傷壞死 三氯甲基自由基還能抑制細胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性 使Ca2 內(nèi)流增加 從而引起細胞中毒死亡 三氯甲基自由基能與蛋白質(zhì)形成共價鍵 損害線粒體使NADH及ATP在肝內(nèi)生成減少 脂肪酸氧化受抑制 影響肝臟能量生成障礙 并使三酰甘油和脂肪酸在肝細胞內(nèi)蓄積 造模機制 大鼠用CCl40 2ml 100g體重做皮下注射 用CCl40 5ml kg體重一次性口服 根據(jù)所用CCl4劑量和時間的不同 肝臟的損傷程度不同 一般在給予CCl4后16 24h血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ALT 和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 AST 活性升高 并能反映肝損傷的程度 形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為肝小葉中央?yún)^(qū)壞死和脂肪變性 操作步驟 結(jié)果 2020 3 31 75 1 CCl4肝損傷模型是最常用的急性肝損傷模型 造模方法簡單 成功率高 重復(fù)性好 價格低廉 2 CCl4劑量不宜過大 以免造成動物中毒死亡 3 CCl4是無色澄清的有毒液體 難溶于水 一般用花生油 橄欖油 豆油等植物油混合成所需濃度 4 用CCl4復(fù)制肝損傷模型的主要缺點是 不同動物個體肝損傷的程度差異較大 小鼠接受CCl4后肝臟病理學(xué)改變與血清ALT等生化指標改變的相關(guān)性不如大鼠好 5 CCl4可從呼吸道 皮膚吸收 對人體有毒性 注意防護 注意事項與模型評價 2020 3 31 76 二 D 半乳糖胺急性肝損傷模型 D 半乳糖胺本身并無毒性 也不直接損傷肝細胞 D 半乳糖胺是肝細胞磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑 進入體內(nèi)后與磷酸尿苷結(jié)合 形成磷酸尿苷 半乳糖胺復(fù)合物 致使磷酸尿苷耗竭 從而使依賴其生物合成的核酸 糖蛋白 脂糖等物質(zhì)的合成受抑制 限制了細胞器及酶的生成和補充 細胞器 生物膜受損 鈣離子內(nèi)流 從而造成肝細胞損傷 D 半乳糖胺引起細胞膜損傷可能與細胞膜中糖成分的改變有關(guān) 即已糖代替了中性糖介入細胞膜 導(dǎo)致膜分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化 2020 3 31 77 二 D 半乳糖胺急性肝損傷模型 D 半乳糖胺致急性肝損傷的劑量取決于動物狀態(tài)等因素 劑量一般按500 850mg kg體重 也有用200 400mg kg體重 一次性腹腔注射 2 24h出現(xiàn)不同程度的肝損傷 如劑量超過1000mg kg體重時 常造成廣泛性肝壞死或動物中毒死亡 一般于注射D 半乳糖胺后24 36h血清ALT AST活性升高 血清膽紅素總量增加 血清總蛋白和清蛋白含量明顯降低 鏡檢可見肝細胞變性 壞死 組織化學(xué)顯示肝細胞糖原和RNA減少 脂肪堆積 2020 3 31 78 二 D 半乳糖胺急性肝損傷模型 方法簡便 成功率高 重復(fù)性好 其病變僅限于肝臟 在引起肝壞死的劑量下 不引起其他臟器病變 對實驗人員安全 因此 D 半乳糖胺肝損傷模型是目前公認的研究病毒性肝炎發(fā)病機制和藥物治療效果的較好模型 D 半乳糖胺與CCl4所致肝損傷的組織學(xué)改變明顯不同 CCl4損傷主要表現(xiàn)在肝小葉中央靜脈周圍區(qū)大量肝細胞壞死和出血 脂肪變性十分明顯 而D 半乳糖胺引起的損傷則呈彌漫性 多發(fā)性片狀壞死 脂肪變性不如CCl4明顯 細胞內(nèi)有大量PAS染色陽性的毒性顆粒 嗜酸性小體較多見 與人類病毒性肝炎的肝損傷類似 2020 3 31 79 四 刀豆蛋白A急性肝損傷模型 ConA是一種植物蛋白 是可活化T細胞的絲裂原 ConA進入小鼠體內(nèi)后可引起與人類類自身免疫性肝炎相似的肝損害 ConA誘發(fā)肝損害主要與下列因素有關(guān) 活化T淋巴細胞 巨噬細胞 促進細胞因子釋放 如TNF IL 2 IFN 等與早期肝細胞損害關(guān)系密切其他如粘附分子 趨化因子 一氧化氮 肝細胞凋亡等也參與了ConA所致肝損傷的發(fā)病過程 2020 3 31 80 四 刀豆蛋白A急性肝損傷模型 小鼠尾靜脈注射ConA3h后 即見血漿ALT AST開始升高 8h后升高明顯 升高的趨勢和速度與ConA劑量呈正相關(guān) 當(dāng)給予ConA劑量為20mg kg體重 2h后肉眼可見肝臟淤血 變暗 并逐漸加重 8h后逐漸減輕 光鏡下可見肝內(nèi)大量T淋巴細胞浸潤 在門管區(qū)尤為明顯 部分門管區(qū)淋巴細胞浸潤呈 套袖 樣改變 肝竇內(nèi)紅細胞淤積 注射后8h可見肝細胞核破裂和凋亡小體等 肝內(nèi)有點狀 片狀肝細胞壞死 壞死區(qū)內(nèi)見淋巴細胞浸潤 2020 3 31 81 四 刀豆蛋白A急性肝損傷模型 本模型是由淋巴細胞介導(dǎo)的肝損害模型 很好地模擬了人類病毒性肝炎 自身免疫性肝病等疾病 是研究這些肝病發(fā)病機制和治療藥物的較理想模型 ConA所致肝損害 無需預(yù)先致敏 一次性尾靜脈注射后2h即可見肝細胞損害 8h肝損害達高峰 制作快速 簡便 ConA致肝損害具有劑量依賴性 選用劑量0 15 30mg kg體重時 肝損害程度隨藥物劑量加大而加重 當(dāng)劑量達20mg kg體重以上時 8h內(nèi)出現(xiàn)小鼠死亡 病變具有肝臟特異性 ConA靜脈注射后8h 組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肺 腎 脾 心等肝外器官損傷 2020 3 31 82 五 四氯化碳慢性肝損傷模型 造模原理 四氯化碳反復(fù)多次給藥 易造成慢性肝中毒 致使肝細胞變性 壞死及纖維組織增生 甚至發(fā)生肝硬化 由于肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂 靜脈回流受阻 肝靜脈與門靜脈高壓 促進肝內(nèi)動靜脈吻合支形成 造成肝細胞供血減少 血清清蛋白降低 血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高 由于肝內(nèi)纖維組織增生 血清總羥脯氨酸含量下降 2020 3 31 83 五 四氯化碳慢性肝損傷模型 操作方法 每周皮下注射遞增濃度的CCl4 劑量為0 2ml kg 1次 濃度由低向高逐漸增加 依次為5 10 20 和30 每2 3周遞增一個濃度 連續(xù)3個月 末次注射CCl448h后 測定血清ALT AST活性 血清總蛋白 清蛋白及總羥脯氨酸含量 取出大鼠肝臟 稱重 計算肝臟系數(shù) g 100g 并對肝臟進行組織病理學(xué)檢查 藥物作用的觀察多采用預(yù)防給藥 即從注射CCl4之前3 4d開始 每日1次 連續(xù)3個月 陽性對照藥可用聯(lián)苯雙酯0 15g kg體重 2020 3 31 84 五 四氯化碳慢性肝損傷模型 注意事項 1 所用CCl4濃度開始不宜過高 否則易引起動物死亡 CCl4濃度增加的速度可根據(jù)動物狀態(tài)掌握 當(dāng)大部分動物狀態(tài)不佳并出現(xiàn)死亡時 不應(yīng)增加濃度 2 采用頸背部皮下注射CCl4 個別動物可出現(xiàn)局部炎癥和硬結(jié) 因此應(yīng)每日更換注射部位 2020 3 31 85 第六節(jié)肝纖維化和肝硬化動物模型 2020 3 31 86 肝纖維化 肝纖維化是指各種致肝臟損傷因素長期反復(fù)作用于肝臟 引起肝細胞變性 壞死和炎癥 在修復(fù)過程中導(dǎo)致ECM異常增多和過度沉積的病理過程 肝纖維化的形成 主要是由于肝星狀細胞激活 ECM成分生成過多 降解相對不足 膠原等ECM在肝內(nèi)大量沉積所致 在我國肝纖維化和肝硬化的主要病因是病毒性肝炎 血吸蟲病 酒精中毒 工業(yè)毒物 藥物 膽汁淤積 循環(huán)障礙和代謝紊亂等 2020 3 31 87 肝纖維化與肝硬化的區(qū)別 肝細胞彌漫性變性 壞死 肝內(nèi)纖維組織增生 肝細胞結(jié)節(jié)狀再生 這三種病變反復(fù)交錯進行 肝內(nèi)血循環(huán)改建 假小葉形成 肝硬化 2020 3 31 88 一 四氯化碳肝纖維化肝硬化模型 如果長期反復(fù)多次給予CCL4 可導(dǎo)致肝內(nèi)纖維增生 逐漸形成肝硬化 該模型較為可靠 復(fù)制時間較短 肝纖維化進展穩(wěn)定 適合于肝纖維化發(fā)生 發(fā)展過程的動態(tài)觀察和研究 是目前國內(nèi)外常采用的動物模型 2020 3 31 89 一 四氯化碳肝纖維化肝硬化模型 操作方法 1 皮下注射40 50 CCl4植物油溶液 首次5ml kg體重 以后2ml kg體重 每周2次 共10周 動物自由飲水進食 2 制備肝臟組織石蠟切片 HE和膠原纖維染色 進行病理學(xué)檢查 2020 3 31 90 一 四氯化碳肝纖維化肝硬化模型 結(jié)果 第2周 肝小葉中央?yún)^(qū)出現(xiàn)片狀肝細胞變性壞死 未見明顯纖維組織增生 第4周 除肝細胞變性壞死外 肝內(nèi)開始形成較薄的纖維間隔 第6周 肝臟纖維間隔進一步增厚 有假小葉形成 第8周 肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞 形成厚的纖維間隔 并分割形成假小葉 實驗中大鼠成活率在60 左右 2020 3 31 91 二 四氯化碳復(fù)合因素模型 造模原理 采用皮下注射CCl4 喂飼玉米面 高脂 高膽固醇食物和飲用酒精等復(fù)合因素復(fù)制肝纖維化肝硬化模型 玉米面蛋白質(zhì)含量只能滿足大鼠正常蛋白質(zhì)需要量的一半 且缺乏色氨酸和蛋氨酸 這些氨基酸均屬于趨脂物質(zhì) 它們的缺乏會導(dǎo)致肝脂肪變 以致纖維化 飼料中加入膽固醇又增加機體對膽堿的需要量 酒精也增加對膽堿的需要量 從而加速肝脂肪變的發(fā)展 高脂食物有利于形成肝細胞脂肪變性 脂肪變性的肝細胞對CCl4損傷作用敏感 酒精能增強CCl4的毒性作用 可直接引起肝細胞線粒體損傷 復(fù)合因素造成大量肝細胞壞死 肝網(wǎng)狀支架塌陷 纖維組織增生 最后發(fā)展為肝硬化 2020 3 31 92 二 四氯化碳復(fù)合因素模型 結(jié)果 大鼠體重下降 第2周時肝細胞變性 壞死 表現(xiàn)為小葉中心出現(xiàn)小片狀肝細胞氣球樣變 脂肪變性 壞死和間質(zhì)輕微炎癥反應(yīng) 鏡下未見明顯纖維增生 血清ALT AST活性升高 血清清蛋白含量減少 肝臟羥脯氨酸含量增加 第4周為纖維增生改變 除肝細胞變性壞死外 肝內(nèi)開始有纖維間隔形成 第6周時為假小葉形成改變 肝臟纖維間隔進一步增寬 肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞 有假小葉形成 導(dǎo)致肝硬化 2020 3 31 93 二 四氯化碳復(fù)合因素模型 模型評價 1 CCl4加高膽固醇和酒精飲食所致大鼠肝纖維化 是目前國內(nèi)外常采用的動物模型 該模型可靠 復(fù)制時間較短 肝纖維化進展穩(wěn)定 適合于肝纖維化 肝硬化發(fā)生發(fā)展過程的動態(tài)研究 是值得應(yīng)用的一種模型 2 如果動物體重較前一次下降30 以上 可停止注射CCl41次 以減少動物死亡率 壞死后性肝硬化 2020 3 31 95 門脈性肝硬化 假小葉 靈長類肝小葉 2020 3 31 96 A 正常肝小葉 Mallory染色 B C 肝硬化 Massontrichrome 2020 3 31 97 第九節(jié)胰腺炎模型 2020 3 31 98 胰液內(nèi)無活性有活性的的胰蛋白酶原胰蛋白酶引起胰腺自身消化其他酶反應(yīng)引起胰蛋白酶被激活的原因 1 膽汁返流 2 胰液分泌亢進 3 病毒感染 外傷 藥物等造成腺泡的損傷 膽汁和腸液中的腸激酶 激活 發(fā)病機制 2020 3 31 99 一 急性胰腺炎模型 牛磺膽酸鈉膽胰管逆行注射法 2020 3 31 100 正常情況下主胰管的壓力高于總膽管 膽汁不會進入胰管 但當(dāng)膽總管阻塞時 膽道內(nèi)的膽汁可被壓入主胰管 引起急性胰腺炎 早期?；悄懰徕c可直接導(dǎo)致胰腺腺泡細胞或小導(dǎo)管壁的細胞溶解 進一步的損害可能是膽鹽激活胰酶 如胰蛋白酶 磷脂酶等 產(chǎn)生腺泡自身消化 采用胰管逆行注射法誘發(fā)動物急性胰腺炎 是根據(jù)胰管 膽管共同通路和膽汁反流理論 模擬人類膽源性胰腺炎的發(fā)病機制大鼠的膽管和胰管為共同開口的管道 解剖上稱為膽胰管 從膽胰管上分出6 8支胰管的分支進入胰腺實質(zhì) 造模機制 2020 3 31 101 操作方法 大鼠實驗前禁食不禁水12h 3 戊巴比妥鈉 40mg kg 腹腔注射麻醉 上腹正中切口進入腹腔 提起胃和十二指腸 顯露出胰腺 辨認膽胰管走向 于肝門處用微型無損傷動脈夾夾閉膽總管 以防藥液逆流進入肝臟 用4號鈍針頭朝胰腺方向穿刺十二指腸前壁 在其漿膜下潛行通過十二指腸乳頭穿入膽胰管 用手指固定針頭 緩慢 約2min 注入3 5 或5 牛磺膽酸鈉溶液1ml kg體重 2020 3 31 102 操作方法 另一種穿刺方法是 用4號針頭緊貼膽胰管匯入十二指腸處 自腸外穿刺膽胰管 注射完畢拔除針頭后繼續(xù)按住穿刺處約1min 檢查無漏膽 逐層關(guān)腹 假手術(shù)組僅翻動胰腺和十二指腸后關(guān)腹 術(shù)后15處死動物 解剖時肉眼觀察胰腺大體變化 取胰腺等組織 10 中性緩沖甲醛液固定 常規(guī)制備石蠟切片 在光鏡下觀察胰腺等臟器的改變 取血測定血清淀粉酶水平 2020 3 31 103 結(jié)果 術(shù)后15h血清淀粉酶水平明顯升高 肉眼觀察 胰腺充血腫脹 包膜緊張 出現(xiàn)不同程度出血壞死 腹腔內(nèi)可見血性腹水 胰腺周圍大網(wǎng)膜和腸系膜出現(xiàn)淡黃色的皂化斑 胃腸道明顯水腫 腎臟明顯增大 顏色晦暗 光鏡檢查 于術(shù)后15h可見胰腺組織大片出血 凝固性壞死及脂肪壞死 壞死區(qū)之間有大量中性粒細胞和單核細胞浸潤 表現(xiàn)為急性出血壞死性胰腺炎 2020 3 31 104 模型評價 本模型在病因 發(fā)病機制及胰腺病變等方面與人類急性胰腺炎相似 是目前被公認的 比較常用的復(fù)制急性胰腺炎的方法 通過改變注射速度 注射持續(xù)時間 所用?；悄懰徕c的濃度或劑量可控制胰腺病