《DNA操作技術(shù)》PPT課件.ppt

第四章 DNA操作技術(shù) DNA操作技術(shù)主要有 切割 連接 縮短 加長(zhǎng) 轉(zhuǎn)錄成RNA 或者合成新的DNA 化學(xué)修飾 或者去掉特殊的化學(xué)基團(tuán) 這些分子操作技術(shù) 不僅是基因克隆的基礎(chǔ) 也是研究生物化學(xué) 基因結(jié)構(gòu) 基因表達(dá)調(diào)控研究的基礎(chǔ) 學(xué)習(xí)內(nèi)容 DNA操作酶核酸酶連接酶聚合酶DNA修飾酶限制性內(nèi)切酶分類和命名酶切體系 反應(yīng)條件 結(jié)果鑒定定位酶切位點(diǎn)連接 1 DNA操作酶 核酸酶 剪切 縮短 降解核酸Bal31E coli外切酶IIIS1內(nèi)切酶DNaseIRNaseH連接酶 連接核酸分子聚合酶 復(fù)制修飾酶 增加或去除化學(xué)基團(tuán)拓?fù)洚悩?gòu)酶 引入或去除超螺旋的閉合環(huán)狀DNA 1 1核酸酶 作用 降解磷酸二酯鍵分為 外切酶內(nèi)切酶 1 1核酸酶 Bal31 來(lái)自于細(xì)菌Alteromonasespejiana 單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性 雙鏈特異的內(nèi)切酶活性 依賴于Ca2 用途 構(gòu)建限制酶圖譜產(chǎn)生末端缺失突變DNA超螺旋線性化 1 1核酸酶 E coli外切酶III只降解DNA分子的一條鏈 產(chǎn)生單鏈的DNA分子 1 1核酸酶 來(lái)自于真菌Aspergillusoryzae的S1內(nèi)切酶作用于單鏈DNA或RNA pH4 0 4 3 Zn2 用途 分析內(nèi)元的位置獲得平端ds DNA酶量大時(shí) 降解雙鏈DNA 1 1核酸酶 來(lái)自于牛胰腺的DNaseI既可以降解單鏈也可以降解雙鏈 沒(méi)有特異性 產(chǎn)生單核苷酸或短鏈 1 1核酸酶 RNaseH E coli 降解RNA DNA雜交分子中的RNA 1 2連接酶 廣泛存在于各種生物中 連接3 端羥基和5 端磷酸形成磷酸二酯鍵 在DNA復(fù)制 修復(fù) 以及體外重組過(guò)程中起重要作用 1 2連接酶 T4 DNA連接酶連接粘性末端 平端修復(fù)雙鏈DNA或RNA DNA雜交雙鏈上的缺口 E coliDNA連接酶連接粘性末端 主要用于cDNA第二鏈的合成 T4 RNA連接酶 1 3聚合酶 依賴DNA的DNA聚合酶不依賴DNA的DNA聚合酶 末端轉(zhuǎn)移酶 依賴RNA的DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶 依賴DNA的RNA聚合酶不依賴DNA的RNA聚合酶 1 3聚合酶 DNA聚合酶I5 3 聚合酶活性3 5 外切酶活性5 3 外切酶活性核酸內(nèi)切酶活性可以被枯草桿菌蛋白酶水解成 Klenow片段和N端具5 3 外切酶活性的分子 1 3聚合酶 1 3聚合酶 Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切酶造成的粘端標(biāo)記DNA探針催化cDNA第二條鏈的合成末端終止法測(cè)序 1 3聚合酶 T4DNA聚合酶與Klenow酶相似 外切酶活性更高 體外誘變反應(yīng)中效率很高 T7DNA聚合酶測(cè)序酶TaqDNA聚合酶 1 3聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNAAMV逆轉(zhuǎn)錄酶 鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞性白血病病毒 DNA聚合酶活性RNaseH活性DNA內(nèi)切酶活性核酸結(jié)合活性M MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 Moloney鼠白血病病毒 1 3聚合酶 兩種逆轉(zhuǎn)錄酶的區(qū)別肽鏈的組成禽酶2條肽鏈 具聚合酶和很強(qiáng)的RNaseH活性鼠酶1條 較弱的RNaseH活性反應(yīng)的最適溫度禽酶42 C 二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富RNA 禽酶效率高反應(yīng)的最適pH值禽酶pH8 3鼠酶pH7 6 1 4DNA修飾酶 堿性磷酸酯酶 來(lái)自于大腸桿菌或小牛腸道 可以去掉DNA分子的5 端的磷酸基團(tuán) polynucleotidekinase 來(lái)自于T4侵染的大腸桿菌 在5 端增加磷酸基團(tuán) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 terminaldeoxynucleotidyltansferase 來(lái)自于小牛胸腺組織 在DNA分子的3 端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸 甲基化酶具有完全相同的識(shí)別序列 1 4DNA修飾酶 甲基化酶 大腸桿菌中的甲基化酶dam甲基化酶在5 GATC3 的腺嘌呤N6位上引入甲基 可使一些識(shí)別順序中含有5 GATC3 的限制性內(nèi)切酶不能切割來(lái)自大腸桿菌的DNA如BclI TGATCA 但BamHI GGATAA 則不會(huì)因?yàn)镹6A的甲基化而失去活性 dcm甲基化酶此酶在序列5 CCAGC3 或5 CCTGG3 中間的胞嘧啶C5上引入甲基 受其影響的限制性內(nèi)切酶是EcoRII 1 4DNA修飾酶 甲基化酶在基因工程中用途許多II類限制性內(nèi)切酶 都存在著相對(duì)的甲基化酶 它們可修飾限制酶識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上 從而使免受切割 如 M EcoRI催化s 腺苷 L 甲硫氨酸 SAM 的甲基轉(zhuǎn)移到EcoRI識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上 從而使DNA免受EcoRI的切割 1 4DNA修飾酶 末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 TDT 3 端突出的雙鏈DNA Mg2 平端或3 凹端的低物 Co2 1 4DNA修飾酶 T4 多核苷酸激酶 T4 PNP 將 磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5 端放射性標(biāo)記DNA的5 端連接反應(yīng)中 使缺少5 端磷酸的DNA片段和接頭磷酸化 1 4DNA修飾酶 堿性磷酸酶 BAP CIP 作用于載體的5 端 提高重組效率作用于外源DNA的5 端 防止自連 1 5拓?fù)洚悩?gòu)酶 在共價(jià)閉合雙鏈上通過(guò)磷酸二酯鍵的短暫斷裂和重新連接解開(kāi)超螺旋在EDTA溶液中也有活性 2限制性內(nèi)切酶 2限制性內(nèi)切酶 RestrictionEndonuclease催化雙鏈DNA分子的斷裂 產(chǎn)生限制性片段 不同來(lái)源的DNA具有不同的酶切位點(diǎn)以及不同的位點(diǎn)排列順序 因此各種生物的DNA均呈現(xiàn)特征性的限制性酶切圖譜 在生物分類 基因定位 疾病診斷 刑事診斷以及基因重組領(lǐng)域起重要作用 并譽(yù)為 分子手術(shù)刀 2限制性內(nèi)切酶 2 1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 早在二十世紀(jì)五十年代發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌對(duì)噬菌體具有免疫性 稱為寄主控制的限制 限制的出現(xiàn)因?yàn)樵谑删w復(fù)制合成新的顆粒之前 細(xì)菌就產(chǎn)生酶降解噬菌體DNA 而細(xì)菌自身的DNA分子的酶識(shí)別位點(diǎn)已被甲基化修飾 這種酶被稱為限制性內(nèi)切酶 1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個(gè)類內(nèi)切酶 HindII和HindIII 為基因工程技術(shù)的誕生奠定基礎(chǔ) 2 2限制性內(nèi)切酶分類 限制性核酸內(nèi)切酶可分為三大類 I類II類 III類 I類限制性內(nèi)切酶 能識(shí)別專一的核苷酸順序 并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈 但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專一性 是隨機(jī)的 代表EcoB EcoK II型 限制性內(nèi)切酶 能識(shí)別專一的核苷酸順序 并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈 II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序 palindrome 即有一個(gè)中心對(duì)稱軸 從這個(gè)軸朝二個(gè)方向 讀 都完全相同 III型限制性內(nèi)切酶 有專一的識(shí)別順序 但不是對(duì)稱的回文順序 在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈 2 3限制性內(nèi)切酶的命名原則 命名原則 取屬名的第一個(gè)字母大寫(xiě) 取種名的前兩個(gè)字母小寫(xiě) 構(gòu)成基本名稱 該種中發(fā)現(xiàn)的不同的酶按照順序編號(hào)I II III等 如存在變種和品系 取變種或品系的一個(gè)字母 若酶存在于質(zhì)粒上 則需大寫(xiě)字母表示非染色體遺傳因子 PvuI識(shí)別CGATCG PvuII識(shí)別CAGCTG 都來(lái)自于Proteusvulgaris HindIII是在Haemophilusinfluenzaed株中發(fā)現(xiàn)的第三種酶 2 3限制性內(nèi)切酶的命名原則 EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質(zhì)粒上 許多內(nèi)切酶識(shí)別6堿基序列 也有的識(shí)別4 5 8核苷酸序列Sau3A來(lái)自于Staphylococcusaureus品系3A 識(shí)別GATC 也有一些酶識(shí)別兼并序列 如HinfI來(lái)自于Haemophilusinfluenzae品系Rf 識(shí)別GANTC N代表A G T C 2 4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 鈍端 平端 粘性末端 粘性末端 是交錯(cuò)切割 結(jié)果形成兩條單鏈末端 這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的 可形成氫鍵 所以稱為粘性末端 垂直線表示中心對(duì)稱軸 從兩側(cè) 讀 核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG 這就是回文順序 palindrome 和 表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置 切割后生成5 G和AATTC 3 3 CTTAA和G 5 二個(gè)DNA片段 各有一個(gè)單鏈末端 二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的 其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA連接酶的作用而 粘合 II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈 產(chǎn)生平頭末端 例如EcoRV的識(shí)別位置是 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 切割后形成5 GAT和ATC 3 3 CTA和TAG 5 這種末端同樣可以通過(guò)DNA連接酶連接起來(lái) 2 4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 同位酶 Isoschizomers 識(shí)別序列相同但切點(diǎn)不同的酶 HpaII和MspI都識(shí)別5 GGCC 3 如其中有5甲基胞嘧啶 則只有HpaII能切割 同尾酶 識(shí)別位點(diǎn)不同 但切出的DNA片段具有相同的末端序列 2 4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 同裂酶 同切酶或異源同工酶 識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同 其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí) 一種限制性內(nèi)切酶可以切割 另一種則不能 Hpa 和Msp 的識(shí)別順序都是5 G CG G 3 如果其中有5 甲基胞嘧啶 則只有Hpa 能夠切割 2 4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 2 4限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物 星號(hào)活力 第二活性 PH離子強(qiáng)度甘油濃度過(guò)高 10 時(shí)酶量限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)非專一性 因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下 2 5DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)目 四堿基的酶平均大約每256個(gè)核苷酸 44 有一個(gè)識(shí)別位點(diǎn) 而六堿基的酶大約4096 46 個(gè)核苷酸有一個(gè)識(shí)別序列 DNA長(zhǎng)49kb 對(duì)于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn) 如BglII只有6個(gè) BamHI只有5個(gè) 而SalI只有2個(gè) 意味著 DNA中GC含量少于50 這種方法只能粗略的估計(jì) 只有實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_定到底有多少個(gè)識(shí)別位點(diǎn) 2 6反應(yīng)程序 體系 DNA分子 溶液 酶緩沖液 一般pH值7 4 含Mg2 NaCl 還原劑如dithiothreitol穩(wěn)定酶阻止失活 水1U定義為在最佳緩沖系統(tǒng)和20ul體積中反應(yīng)1小時(shí) 完全水解1 gDNA所需的酶量反應(yīng)條件一般為37 C 也有例外 如TaqI在65 C時(shí)活性最高 2 6反應(yīng)程序 1 加入DNA2 加入Buffer3 加入酶4 37 C保溫1hr或過(guò)夜5 反應(yīng)終止 70 C加熱 加入EDTA 或加入苯酚 2 7酶切結(jié)果分析 通過(guò)凝膠電泳分離 根據(jù)分子量分離 聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1 300bp的分子 瓊脂糖凝膠電泳 Standardelectrophoresis a doesnotseparateDNAfragmentsofdifferentsizes whereasgelelectrophoresis b does 2 7酶切結(jié)果分析 DNA分子的檢測(cè)EB染色 DNA分子小于25ng 很難檢測(cè)到放射性自顯影 可檢測(cè)2ngDNA 2 7酶切結(jié)果分析 0 5 g的1kbDNALadder0 8 TAE瓊脂糖凝膠 EB染色 2 8估計(jì)DNA分子的大小 D a b logM D 移動(dòng)距離 M 分子量 a b是恒量 與已知大小的片段進(jìn)行比較 誤差約5 Figure4 16EstimationofthesizesofDNAfragmentsinanagarosegel Figure4 17UsingarestrictionmaptoworkoutwhichrestrictionendonucleasesshouldbeusedtoobtainDNAfragmentscontainingindividualgenes 2 9繪制DNA分子的酶切圖譜 確定每一種酶切后產(chǎn)生片段的分子量和數(shù)目 進(jìn)行雙酶切 比較單酶切和雙酶切結(jié)果 繪制酶切圖譜 含糊的位點(diǎn)可以通過(guò)部分酶切解決 繪制酶切圖譜 繪制酶切圖譜 繪制酶切圖譜 2 10多酶聯(lián)合酶解 對(duì)離子強(qiáng)度要求相同的酶 可同時(shí)酶解 對(duì)離子強(qiáng)度要求不同的酶 低鹽濃度的酶先切 后補(bǔ)加NaCl一種酶切后 沉淀DNA 換緩沖液 Figure4 19Ligation thefinalstepinconstructionofarecombinantDNAmolecule Figure4 20ThedifferentjoiningreactionscatalysedbyDNAlligase 外源DNA與載體DNA的連接 相同粘性末端的連接平頭末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接粘性末端的更換 3 1相同粘性末端的連接 來(lái)源相同的酶同尾酶問(wèn)題極性有兩種可能同尾酶連接后 不能用任何一種酶酶切 稱為 焊死 BamHI識(shí)別順序5 G GATCCG GATCC3 CCTAG GCCTAG GBglII的識(shí)別序列5 A GATCTA GATCT3 TCTAG ATCTAG AAGATCCGGATCTTCTAGGCCTAGA EaeI的識(shí)別序列PyGGCCPu Py表示嘧啶 Pu表示嘌呤 EayI的識(shí)別序列CGGCCG連接后重組分子僅能為EaeI識(shí)別 3 2平頭末端的連接 粘性末端 分子內(nèi)部連接 平頭末端 分子間的連接 提高連接效率的方法 加大酶用量 10倍 加大平頭末端底物的濃度加入10 PEG 8000 促進(jìn)分子間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子 150 200mMNaCl提高反應(yīng)溫度平頭連接同樣存在兩種極性 3 3不同粘性末端的連接 突出5 末端Klenow補(bǔ)平 或S1核酸酶切平 然后平頭連接突出3 末端T4 DNApol切平 然后平頭連接突出末端不同Klenow補(bǔ)平 或S1核酸酶切平連接后 可能恢復(fù)限制性位點(diǎn) 甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn) XbaI與HindIII XbaI恢復(fù) XbaI與EcoRI 均保留 BamHI與BglII 產(chǎn)生ClaI位點(diǎn) 3 4人工粘性末端的連接 5 突出的末端外源片段先用Klenow補(bǔ)平 然后用TdT補(bǔ)加polyC 載體片段也用Klenow補(bǔ)平 加polyG 退火不經(jīng)連接即可轉(zhuǎn)化 目的是 不使酶切位點(diǎn)遭受破壞 3 突出的末端外源片段先用TdT加polyG 載體片段加polyC 然后退火 再用Klen