顧振綸—金蟬花孢子粉及野生金蟬花粗多糖—抗腫瘤作用初步報告

金蟬花孢子粉及野生金蟬花粗多糖抗腫瘤作用初步報告,Applied report of Cordyceps cicadae and polysaccharide of wild cordycepssobolifera on Anti-tumors,2011年3月18日 香港,一、前 言,Introduction,蟬花Cordyceps cicadae屬蟲生性藥用真菌，生于蟬蛹體上，是蟬在羽化前，接近地面約34cm處，被蟬擬青霉等麥角菌科( Claviceptaceae)真菌寄生的產(chǎn)物。,其藥用始載于南北朝劉宋時代的雷公炮炙論。唐慎微所著經(jīng)史證類備急本草言 “蟬花味甘寒，無毒，主小兒天吊，驚癇，夜啼，心悸”。本草綱目中亦記載：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。,醫(yī)家認為蟬花是:一種與冬蟲夏草相近的珍貴藥材。,1. 蟬花的分類,大蟬草 大蟬草又名金蟬花，其子座一般單生、2個或多個，不分枝，棒狀，褐色；寄生的蟬若蟲較大。小蟬花 麥角菌科蟲草屬真菌小蟬草寄生于蟬科慈姑（Platylenre Kaempferi Fabr）幼蟲的體內(nèi)所抽出的子座及寄生幼蟲尸體的干燥復(fù)合體。,蟬生蟲草 其子座聚生至近叢生，從成蟲寄主的整個腹部長出，子囊殼斜埋在子座內(nèi)。蟬擬青霉 蟬擬青霉又名雌蟬花，屬半知菌類或有絲分裂孢子真菌，其孢梗束自蟲體頭部叢聚成束長出，淺黃色，長 1.56.0cm，前端膨大，呈紡錘形。,2. 蟬花的藥理作用, 免疫調(diào)節(jié)作用 調(diào)節(jié)脂類代謝 滋補強壯，提升機體的營養(yǎng)狀況 抗疲勞，抗應(yīng)激 解熱鎮(zhèn)痛催眠作用 降血糖作用 抗腫瘤作用,日本學(xué)者Ukai等從蟬花中分離出一種水溶性多糖即半乳甘露糖，它由D-甘露糖和 D-半乳糖構(gòu)成，二者比例4：3。當(dāng)劑量為20mg/kg時，對小鼠S180肉瘤的抑制率為47。 蟬花粗提物能選擇性殺傷 G2/M期細胞，顯著抑制肺癌細胞株 PAA細胞生長。,一定濃度的蟬擬青霉多糖能使人外周血單個核細胞的增殖率升高，較高濃度多糖能抑制白血病細胞株U937、 K562的增殖，同時蟬擬青霉多糖能提高外周血單個核細胞表達 nTNF-、nIFN-。,Materials and Methods,二、材料與方法,1. 藥品 人工培養(yǎng)金蟬花孢子粉（孢子粉），批號：101201 野生金蟬花粗多糖（粗多糖），批號：110128 均由上海泛亞生命科學(xué)研究院提供 人工培養(yǎng)金蟬花孢子粉醇提物由蘇州中藥研究所植化室制備。 人工培養(yǎng)金蟬花孢子粉醇提物、野生金蟬花粗多糖 均用DMSO溶解后配成100mg/ml（DMSO含量5），4保存。,2. 實驗用腫瘤細胞（由中國科學(xué)院上海細胞庫供應(yīng)）,3. 主要試劑： DMEM（高糖）、MEM及1640培養(yǎng)基，批號：1361834，Hyclone 產(chǎn)品。 胎牛血清（FBS），Hyclone 產(chǎn)品。 四氮唑藍 (MTT)、胰酶、二甲基亞砜（DMSO）、RNA酶（Rnase）、 碘化丙錠(Propidium Iodide，PI)，均為Sigma產(chǎn)品。 戊二醛、鋨酸等制作電鏡樣本所需試劑，由蘇州大學(xué)電鏡室提供。 Annexin V/PI 雙染試劑盒：Biouniquer Technology Co. LTD Wright-giemsa染色試劑盒：蘇州金萊生物科技有限公司。,4. 主要儀器設(shè)備 CO2 培養(yǎng)箱，Napco 5410 型，Napco 公司，美國。 醫(yī)用凈化工作臺，YJ-1450 B 型，吳江市設(shè)備凈化總廠。 倒置顯微鏡，CKX41，OLYMPUS 公司，日本。 酶聯(lián)免疫檢測儀，DG5032 型，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司。 流式細胞儀，EPICS XL 型，Beckman-Coulter 公司，美國。 熒光顯微鏡，IX71 型，OLYMPUS 公司，日本。 高速低溫離心機，5417R 型，Effendorf 公司，德國。 透射電子顯微鏡，H-600 型，Hitachi 公司，日本。 掃描電子顯微鏡，S-4700型，日立公司，日本。,三、實 驗 結(jié) 果,Results,（一）四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測結(jié)果,Fig. 1-1A. The inhibited rates of Cordyceps cicadae were detected by MTT assay （n=6）,表1-1A 金蟬花孢子粉對9株腫瘤細胞生長抑制率的影響 （n=6）,*P0.05, *P0.01 vs control group,*P0.05, *P0.01 vs control group,表1-1B 金蟬花孢子粉對11株腫瘤細胞生長抑制率的影響（n=6）,表1-2A 野生金蟬花粗多糖對9株腫瘤細胞生長抑制率的影響 （n=6）,Tab. 1-2A. The inhibited rates of Cordyceps cicadae polysaccharide were detected by MTT assay. （n=6）,*P0.05, *P0.01 vs control group,*P0.05, *P0.01 vs control group,表1-2B 野生金蟬花粗多糖對11株腫瘤細胞生長抑制率的影響（n=6）,（二） 瑞氏吉姆薩（Wright-giemsa）染色結(jié)果,Fig. 2-1 Effect of on SW1990 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,圖2-1 金蟬花對人胰腺癌SW1990細胞形態(tài)學(xué)的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,I,A control,B 50g/ml,C 100g/ml,D 250g/ml,I 100g/ml,F 1mg/ml,G 5-Fu(5),H 50g/ml,J 250g/ml,K 500g/ml,L 1mg/ml,E 500g/ml,孢子粉,粗多糖,圖2-2 金蟬花對人宮頸癌Hela細胞形態(tài)學(xué)的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：蟬花粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-2 Effect of on Hela (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,圖2-3 金蟬花對人回盲腸癌ccl-244細胞形態(tài)學(xué)的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-3 Effect of on ccl-244 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,粗多糖,孢子粉,圖2-4 金蟬花對人橫紋肌肉瘤RD細胞形態(tài)學(xué)的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-4 Effect of on RD (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,圖2-5 金蟬花對人膠質(zhì)瘤LN229細胞形態(tài)學(xué)的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：環(huán)磷酰胺）,Fig. 2-5 Effect of on LN229 (Light microscope 200) A: control group; H-L: Cordyceps cicadae for 48h respectively; G-K: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:100 M Cy.,粗多糖,孢子粉,圖2-6 金蟬花對人胃癌HGC-27細胞形態(tài)學(xué)的影響（A：正常組；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖組；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-6 Effect of on HGC-27 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,上述結(jié)果表明：人工培養(yǎng)金蟬花孢子粉和野生金蟬花粗多糖對體外培養(yǎng)的人胃癌HGC27、人白血病K562和PBL985/GPD、人橫紋肌肉瘤RD、人宮頸癌Siha、Hela、人胰腺癌SW1990、人膠質(zhì)瘤LN229及人回盲腸癌ccl-244細胞等腫瘤細胞的增殖有一定的抑制作用。,（三） 流式細胞儀（PI單染）檢測結(jié)果,G1期： DNA合成前期,S期：DNA合成期,G2期：DNA合成后期,M期：有絲分裂期，DNA的復(fù)制,Cell Cycle,圖3-1 金 蟬花對人胰腺癌SW1990細胞周期的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.3-1 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of SW1990 treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,圖3-2 金蟬花對人白血病K562細胞周期的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶 ）,Fig.3-2 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of K562 treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide;D: 5 M 5-Fu.,圖3-3 金蟬花對人宮頸癌Hela細胞周期的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.3-3 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of Hela treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,表3-1 金蟬花對人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞周期的影響,Tab.3-1 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of SW1990、K562 and Hela treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide.,流式細胞儀（PI單染）檢測結(jié)果表明： 金蟬花孢子粉醇提物和野生蟬花粗多糖可使人胰腺癌SW1990及人白血病K562細胞周期阻滯在G2期； 金蟬花孢子粉醇提物可使人宮頸癌Hela細胞周期阻滯在G1期。,腫瘤細胞死亡有哪幾種形式？,腫瘤細胞死亡的主要形式： 壞死（necrosis） 凋亡（apoptosis） 壞死性凋亡（necroptosis ） 自噬（autophagy）,（四） 流式細胞儀（Annexin V/PI雙染）檢測結(jié)果,金蟬花能否誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡？,圖4-1 金 蟬花對人胰腺癌SW1990細胞凋亡的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.4-1 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in SW1990 after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,3.85%,43.77%,12.11%,5.31%,A,B,C,D,左上象：死亡細胞,左下象：活細胞,右上象：晚期凋亡細胞,右下象：早期凋亡細胞,圖4-2 金蟬花對人白血病K562細胞凋亡的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.4-2 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in K562 after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,Fig.4-3 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in Hela after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,圖4-3 金蟬花對人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響（A：正常組；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,表4-1 金蟬花對人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響,Tab.4-1 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in SW1990、K562 and Hela after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h.,流式細胞儀（Annexin V/PI雙染）初步觀察結(jié)果: 金蟬花孢子粉作用人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞48小時后，凋亡率分別為43.17%、52.59%和 86.75% ； 蟬花粗多糖作用人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宮頸癌Hela細胞48小時后，凋亡率分別為12.11%、33.35%、 57.5% 。,（五） 電鏡觀察結(jié)果,核大，核型不規(guī)則，有切跡，核質(zhì)比值大，核仁明顯，細胞器豐富。（18000）,給藥前人胰腺癌細胞,胞核內(nèi)核膜旁異染色質(zhì)邊集，細胞膜溶解消失，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張 ，呈壞死性凋亡。（12000）,孢子粉（1mg/ml）,圖 5-1. 透射電鏡觀察金蟬花對人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞超微結(jié)構(gòu)的影響,胞核變小，核漿比值減小，核仁減小，異染色質(zhì)增多，沿核膜邊集，呈早期凋亡形態(tài) （22500） 。,核膜旁異染色質(zhì)邊集，胞漿內(nèi)空泡變性，可見自噬小體（18000） 。,人胰腺癌細胞粗多糖組（1mg/ml）,人胰腺癌細胞粗多糖組（1mg/ml）,核型不整，核膜有切跡，核漿比值大，雙核仁，細胞表面有微絨毛（9000）。,給藥前人宮頸癌Hela細胞（1mg/ml）,核小，核異染色質(zhì)邊集在核膜旁，未見核仁 （22500）。,人宮頸癌Hela細胞孢子粉組（1mg/ml）,人宮頸癌Hela細胞孢子粉組（1mg/ml）,核膜旁異染色質(zhì)邊集，可見自噬小體，脂質(zhì)空泡（30000）。.,核膜旁異染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，細胞膜破損，呈壞死性凋亡（ 9000 ）,人宮頸癌Hela細胞粗多糖組（1mg/ml）,透射電鏡觀察結(jié)果表明： 1. 金蟬花孢子粉和粗多糖可誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990、人宮頸癌Hela細胞和人胰腺癌SW1990細胞凋亡。 2. 金蟬花孢子粉和粗多糖可誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞壞死性凋亡。 3. 金蟬花孢子粉和粗多糖可誘導(dǎo)人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞自噬。,金蟬花孢子粉和粗多糖對腫瘤細胞形態(tài)和 腫瘤細胞膜有什么影響呢？,細胞分裂末期，其中數(shù)對子細胞逐步分開，子細胞呈橢圓形（1000）。,給藥前人胰腺癌SW1990細胞,細胞呈不規(guī)則梭形，表面不平，有細長突起，較多微絨毛結(jié)構(gòu)（ 1000）。,圖5-2 掃描電鏡觀察人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞表面結(jié)構(gòu),人胰腺癌SW1990孢子粉組（1mg/ml）,細胞變形，微絨毛減少，細胞表面塌陷，伴穿孔改變（1000）。,細胞變形，懸浮，表面塌陷，有裂縫，穿孔，微絨毛減少或消失，伴穿孔改變（ 800 ）。,人胰腺癌SW1990粗多糖組（1mg/ml）,給藥前人宮頸癌hela細胞,細胞表面密布微絨毛，邊緣有突起（1500）,細胞變形明顯，細胞膜表面有穿孔（1500）。,人宮頸癌hela細胞孢子粉組（1mg/ml）,細胞變細長，類似神經(jīng)細胞樣形態(tài)改變，細胞膜表面微絨毛減少（ 3000 ）。,人宮頸癌hela細胞粗多糖組（1mg/ml）,細胞變形，細胞膜缺損，有穿孔（1000）。,細胞變形，微絨毛減少，穿孔明顯（3000）。,掃描電鏡初步觀察結(jié)果： 金蟬花孢子粉和粗多糖可使人胰腺癌SW1990及人宮頸癌Hela細胞變形，細胞膜發(fā)生穿孔、空洞等改變，破壞細胞膜的完整性。,綜上所述，我們從腫瘤細胞的形態(tài)、細胞膜結(jié)構(gòu)、細胞內(nèi)亞微結(jié)構(gòu)、細胞增殖動力學(xué)及細胞死亡途徑等方面初步觀察了金蟬花的抗腫瘤作用。 我們在初步的實驗研究中有什