男性不育與輔助生殖技術(shù)

男性不育與輔助生殖技術(shù),“百米沖刺”,男性不育定義,WHO規(guī)定：夫婦未采用任何避孕措施性生活1年以上，由于男方因素造成女方不孕者，稱為男性不育男性不育癥不是一種獨立的疾病，而是由某一種或很多疾病與因素造成的結(jié)果,男性不育的概況,10-15%生育年齡的夫婦有不育癥 男性不育占不育原因的 40% 我國男性的精液質(zhì)量呈下降趨勢，正以1的速度下降 在工業(yè)化程度越高的地區(qū)，精子質(zhì)量降低越明顯 無精癥占男性不育癥的 7-13% 有7-11%的無精癥患者有染色體異常,男性不育的病因,睪丸前因素睪丸性因素睪丸后因素,男性不育的診斷 病史,全面了解家族遺傳史、婚育史、性生活史、過敏史、手術(shù)外傷史和其他對生育可能造成影響的因素，還要簡要了解女方病史，記錄患者的個人信息既往史：重點了解與生育相關(guān)的疾病和因素，主要包括腮腺炎、睪丸炎、發(fā)燒、附睪炎以及手術(shù)外傷史，內(nèi)分泌史、性功能、用藥史、生活習慣。環(huán)境與職業(yè)因素等,男性不育的診斷 體格檢查,全身檢查：重點注意第二性征的情況，體型、皮膚、喉結(jié)、毛發(fā)分布等生殖器官的檢查：陰莖、睪丸、附睪、輸精管、精索直腸指診：前列腺、精囊,男性不育癥實驗診斷基礎(chǔ),1.男性不育癥實驗診斷概況,男性不育癥的實驗診斷方法過去長期停留在較低水平，不育癥病因臨床診斷困難。WHO制定了多項男性不育實驗和臨床診斷技術(shù)規(guī)范。正確認識輔助生殖技術(shù)（ART）的作用和適用范圍。,男性不育癥診療基本程序（WHO）： 不育男性 病因?qū)W診斷 治療或償試治療 男科學 考慮ART助孕 選擇最適ART助孕方式 輔助生殖技術(shù),男性不育癥現(xiàn)代實驗診斷技術(shù) 精液計算機輔助分析 精子功能檢測 精液免疫生化檢驗 細胞遺傳學檢查 分子生物學 尤以精液免疫生化檢驗發(fā)展得最快,具有十分重要的診斷價值。,精液常規(guī)參考值（WHO Laboratory Manual, CUP, 4th edn,1999）,量 2 ml， 6mlpH7.2 7.8液化時間 15%*活率 75%活精(除外伊紅染精）白細胞數(shù) 1 106/ ml免疫珠試驗 50%活精與免疫珠粘附混合抗免疫蛋白試驗 50%活精有粘附顆粒,* 精子正常形態(tài) 15%, 體外受精率下降.,精液異常的定義（WHO Laboratory Manual, CUP, 4th edn,1999）,少精癥 (Oligozoospermia)精子密度 20 106/ ml弱精癥 (Asthenozoospermia) 50%向前運動(a+b)或 25%快速向前運動(a)畸形精癥 正常形態(tài)精子 30% 少弱畸精癥 (Oligoasthenteratospermia)以上三個或二個變量異常無精癥(Azoospermia) 射出精液中(包括離心)無精子隱匿精子癥不射精(Aspermia)逆行射精,生精功能評價指標： 血激素：FSH、LH、 T、PRL、E2 血清抑制素B 生殖細胞凋亡 染色體及無精子候 選基因,常用血激素,FSH特性：垂體前葉分泌；不是總能準確預測生精功能狀態(tài)； 一般 地，血FSH水平與精原細胞的數(shù)量緊密相關(guān),精原細胞缺乏或明顯減少時,血FSH常常會升高.當精原細胞數(shù)量正常,但出現(xiàn)精母細胞或精子細胞完全性生精阻滯時,血FSH一般在正常范圍。,血激素檢測注意事項: FSH濃度水平相對穩(wěn)定可靠; LH、T、PRL濃度均易產(chǎn)生生理波動； 應(yīng)注意對抽血時間的有序把握，及注意對抽血前影響因素的控制。,精液在生殖管道中運輸檢測指標,附睪分泌功能指標-精漿中性葡糖苷酶,Seminal plasma neutral alpha- glucosidase WHO推薦檢測方法：Cooper法（PNPG法）臨床意義： 附睪分泌功能的指標。中性-葡糖苷酶較左 旋肉毒堿和甘油磷酸膽堿對附睪更特異更靈 敏。 結(jié)合精漿果糖、激素和睪丸其他指標,對遠端 輸精管阻塞有較好的診斷價值。,精囊分泌功能指標-精漿果糖,Seminal plasma fructose WHO推薦檢測方法：吲哚法或酶法 臨床意義： 精囊分泌的果糖是精子能量的主要來源。先天性精囊缺如果糖測定為陰性。精囊炎時，果糖含量降低。不完全射精或射精過頻，果糖含量亦降低。用于鑒別單純性輸精管阻塞所致的無精癥（果糖含量正常）和輸精管、精囊發(fā)育不良引起的無精癥。,前列腺分泌功能指標（WHO推薦） 精漿檸檬酸定量（酶法） （Seminal plasma citric acid ） 精漿酸性磷酸酶定量（PNPP法） （Seminal plasma acid phosphatase ） 精漿鋅定量（5-Br-PAPS法）（Seminal plasma zinc ）,靜止性生殖道感染性檢測,精液白細胞過氧化物酶染色（Leukocyte Peroxidase）精液白細胞群組化酶免定量（Leukocyte Subpopulations ）精漿粒細胞彈性硬蛋白酶定量（PMN-elastase）,精液圓細胞(rouud cell)： 生殖道上皮細胞、生精細胞和白細胞統(tǒng)稱之。正常精液： 圓細胞數(shù)5106/ml; 白細胞數(shù)50%有確定臨床意義。 I BT: 20%為可疑, 50%有確定臨床意義。,性交后試驗,意義禁欲至少兩天 準確推算排卵期 前一天夜間同房，禁用潤滑劑，性交后不能行陰道沖洗及盆浴 924小時取精,精子低滲膨脹試驗(HOS),Sperm Hypo-Osmotic, HOS臨床意義: WHO不主張將HOS作為精子功能試驗予以應(yīng)用. 是一種檢查精子存活力的補充試驗方法. 有研究表明：HOS與去透明帶地鼠卵穿透試驗 之間有較好的符合率,對繼發(fā)性不育者更有價值.,精子頂體酶 acrosin,臨床意義 : 頂體酶是受精過程中不可缺少的蛋白水解酶。頂體酶活性可反映精子質(zhì)量，頂體酶活力不足可導致不育。 臨床精子成活率低、死精子癥以及嚴重生殖系統(tǒng)感染，特別是溶脲支原體嚴重感染時可造成精子頂體酶活性降低。 頂體酶活性是判斷男性精子功能和生育力強弱的重要評價指標。,檢測方法： Kennedy法（BAPNA法）： 精氨酸酰胺酶 BAPNA 硝酰基苯胺 （BAPNA： N-苯甲酰-DL-精胺酸-硝?；桨?） 不足之處： 反應(yīng)時間過長（3小時） BAEE（苯甲酰精氨酸乙酯）法：,精子頂體酶活性檢測標本留??； 頂體酶檢測標本：原精液與洗滌后精子。 精子頂體酶活性檢測常見實驗檢測錯誤。,精子懸液活性氧類物質(zhì)(ROS) reactive oxygen species, ROS,臨床意義：活性氧類是氧的代謝產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫、氫氧根、過氧化氫和一氧化氮。過量存在可誘發(fā)細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷而造成病理性損傷。許多細胞具有酶性抗氧化劑系統(tǒng)（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶）或非酶性抗氧化劑系統(tǒng)（尿酸、維生素C、維生素E）。當這些防御機制受制時，細胞功能將受到影響。,精子形態(tài)學染色SpermMorphology Staining,吉姆薩染色-評價不同類型白細胞比評價精子更好(改良)巴氏染色-經(jīng)典方法肖爾(Shorr)染色-常規(guī)精子形態(tài)分析勃-利二氏(Bryan-Leishman)染色-適用于鑒定未成 熟生殖細胞和未成熟生殖細胞與白細胞的鑒別Diff-Quik染色-精子形態(tài)學分析,精子形態(tài)學染色（Diff-Quik）,精子形態(tài)學計算舉例：計數(shù)的精子數(shù)： 200正常精子數(shù)： 78正常精子百分比：（78/200100%） 39% 缺陷精子數(shù)：（200-78） 122（61%） 頭部缺陷精子數(shù)： 110（55%） 中段缺陷精子數(shù)： 18（9%） 尾部缺陷精子數(shù)： 16（8%） 缺陷總數(shù)：（110+18+16） 144畸形精子指數(shù)(TZI) = (缺陷總數(shù)/ 缺陷精子數(shù)) = 144/122=1.18精子畸形指數(shù)(SDI) = (缺陷總數(shù)/所數(shù)精子總數(shù)) = 144/200=0.72,當精子畸形率70%或畸形精子指數(shù)(TZI) 1.6時，可引起生育障礙，導致不育癥。來自輔助生殖技術(shù)項目的資料表明，使用本方法所描述的分類方法，如果正常形態(tài)的精子數(shù)低于15%或精子畸形指數(shù)(SDI) 1.6時，體外受精率降低。正常精子形態(tài)14% (Kruge & Menkfeld標準),計算機輔助精子分析 Computer aided of semen analysis，CASA,CASA較人工方法具有以下優(yōu)點： 高精確性； 提供精子動力學的量化數(shù)據(jù)。根據(jù)識別精子原理分類,CASA分為: 灰度識別 熒光識別 比色識別 (880nm),灰度CASA的特點:精子活力分級: a級: 快速前向運動 (VAP26m/s) b級: 中速前向運動 (16VAP26m/s) c級: 慢速前向運動 (6VAP16m/s) d級: 極慢或不動 (0VAP6m/s) 灰度CASA無法檢測出“精子成活率”，需進一步作活體染色（如：HOS，伊紅染色） 同一精液標本a+b+c值低于實際“精子成活率”。,灰度CASA的特點:精子識別: 根據(jù)成像灰度識別精子,易將精液雜質(zhì)誤識別為精子,需要人工干預幫助識別。,CASA臨床應(yīng)用存在的普遍性問題： 在精液未經(jīng)其他技術(shù)處理狀態(tài)下報告精液白 細胞數(shù)量； 在精液未經(jīng)其他技術(shù)處理狀態(tài)下報告精子形 態(tài)學； 精子密度計數(shù)重復性差； 精子活力計數(shù)重復性差； 同一實驗室不同技術(shù)人員檢測結(jié)果差異較大； 不同實驗室間檢測結(jié)果無可比性。,3. 精子功能評價指標,與精子功能相關(guān)的實驗檢測項目：標準化的精液分析（包括CASA 活動力與速度）精子膜完整性（HOS,LDH-X）；精子核蛋白成熟度(苯胺藍染色)/DNA受損度(吖啶橙染色)；精子抗體（免疫珠試驗）精子-宮頸粘液相互作用：體內(nèi)試驗（性交后試驗) 體外試驗（毛細管試驗）頂體酶和誘發(fā)頂體反應(yīng)精子-卵母細胞相互作用,誘發(fā)頂體反應(yīng)Induced acrosome reaction,WHO推薦方法：鈣離子載體法 精子體外獲能后，通過鈣離子載體啟動頂體反應(yīng)，用于評價 精子發(fā)生頂體反應(yīng)的能力。 幾種凝集素在AR前后精子的結(jié)合位點：,睪丸活檢術(shù),睪丸切開活檢術(shù)（testicular open biopsy） 睪丸穿刺活檢（testicular puncturation biopsy ）睪丸細針抽吸活檢（fine needle aspiration biopsy,FNA）睪丸活檢意義的變遷（由一種診斷方法演變成治療手段）,睪丸鉗穿活檢術(shù),正常生精功能,成熟精子,支持細胞,精母細胞,Part 3,生精功能低下（同一病人）,減少,缺如,Part 3,生精功能缺如,（47，XXY),睪丸間質(zhì)纖維化，透明樣變,Part 3,供精人工授精(AID) 適應(yīng)癥：精液質(zhì)量低下：無精子癥、嚴重少弱精癥、畸形精子癥優(yōu)生目的：男方和/或家族有不宜生育的嚴重遺傳病、智力低下、精神病、近親婚配、腫瘤患者經(jīng)過化療或放射治療后特殊情況：截癱、不射精、逆行射精治療失敗母兒血型不合不能得到存活新生兒,男性不育的輔助生育治療,男性不育的輔助生育治療,宮腔內(nèi)人工授精(AIH)適應(yīng)癥： 男性因少精、弱精、液化異常、性功能障礙、生殖器畸形等不育宮頸因素生殖器道畸形及心理因素導致性交不能等不育免疫性不育 原因不明不育,男性不育的輔助生育治療,單精子卵漿內(nèi)注射術(shù)(ICSI) 適應(yīng)癥：嚴重男性不育：少精、弱精、畸形精癥，無精癥（睪丸活檢有成熟精子） 常規(guī)試管嬰兒受精失敗，或受精率極低,a)sperm concentration 精子濃度 2 x 106b)sperm motility 精子活率 5 %c)strict criteria normal morphology 嚴格標準的精子正常形態(tài) 4 %d)use of surgically retrieved spermatozoa 使用通過外科手術(shù)獲得的精子e)failure of fertilization in a previous IVF cycle 前一個常規(guī)IVF受精失敗,Cornell University ICSI適應(yīng)癥,ICSI 適應(yīng)癥 本中心,嚴重少、弱畸精癥：3次檢查內(nèi)至少有2次以上精液常規(guī)檢查符合以下任一標準者：一次射精的活精子濃度 1106/ ml 精子濃度 20106/ ml，同時a+b級運動精子20%，或形態(tài)正常精子20106/ ml，按嚴格標準進行精子形態(tài)學檢查，形態(tài)正常精子10% 或a+b級精子活動率10% 精液處理后活精濃度1106/ ml，a+b級運動精子50% 梗阻性無精癥或生精功能障礙，附睪或睪丸活檢有成熟精子者 重度畸精癥：精子正常形態(tài)數(shù)4冷凍后的少弱精2次以上不明原因IVF-ET受精失敗或受精率低于30% 精子無頂體或頂體功能異常 （誘導頂體反應(yīng)率5）IVM周期 PGD周期,外科取精方法,顯微附睪精子抽吸術(shù)Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration (MESA)經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù) Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration（PESA)睪丸精子抽吸術(shù) Testicular Sperm Aspiration (TESA)睪丸穿刺取精術(shù)Testicular Puncturation Biopsy 睪丸精子抽提術(shù) Testicular Sperm Extraction (TESE)睪丸顯微切開活檢取精術(shù)(Micro-TESE),顯微附睪精子抽吸術(shù)Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration (MESA),經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration (PESA),睪丸精子抽吸術(shù)Testicular Sperm Aspiration (TESA),睪丸精子抽提術(shù)Testicular Sperm Extraction (TESE),睪丸鉗穿取精術(shù),經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù) (percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)睪丸精子抽吸術(shù) (testicular sperm aspiration,TESA) 睪丸穿刺取精術(shù)(testicular puncturation biopsy) 睪丸精子抽提術(shù) （Testicular Sperm Extraction