4動物細胞培養(yǎng)大實驗.ppt

實驗九培養(yǎng)細胞的凍存 培養(yǎng)細胞要即時留種 轉(zhuǎn)運 須要進行保存操作 方法 不斷傳代法 低溫保存法 20 超低溫凍存法 196 細胞數(shù)對數(shù)值 培養(yǎng)時間 周 024810121420 細胞系 無限細胞系 死亡 原代 第一次傳代 轉(zhuǎn)化 超低溫凍存 難點 冷凍速度過慢 當溫度降到冰點時 細胞外的水分會形成冰晶 滲透作用使細胞脫水 蛋白質(zhì)及酶活性改變 造成化學損傷 冷凍速度過塊 細胞內(nèi)水分來不及滲出 形成冰晶 破壞細胞結(jié)構(gòu) 造成物理傷害 細胞代謝 生長完全停止 但不會喪失形態(tài)發(fā)生的潛能 不會使遺傳性狀改變 理論上可無限期保存 辦法 冷凍保護劑 可滲透入細胞 與水分子結(jié)合 降低細胞冰點 使細胞內(nèi)水分有時間充分滲出 從而減少細胞內(nèi)冰晶的形成 冷凍速度 25 以上 按1 2 min的梯度降溫 25 以下 按5 10 min的梯度降溫 達到 100 時 投入液氮 196 二甲亞砜 DMSO 冰點 體液 甘油 繭蜂 超冷 實驗用品 手術(shù)器件 1套 移液管 1包 凍存管 2個 離心管 2支 小青瓶 1個 吸管 1包 Hanks液 1瓶 消化液 1瓶 完全培養(yǎng)液 1瓶 二甲基亞砜 DMSO 水浴箱 液氮罐 凍存盒 實驗過程 觀察培養(yǎng)細胞生長旺盛 即可進行凍存 取培養(yǎng)瓶倒掉培養(yǎng)液 加5mlHanks液 輕洗后倒出 加入3ml消化液 擰緊瓶蓋 平握在手中 消化約10 15分鐘 其間不時輕搖幾次 鏡下觀察細胞變圓 脫落漂動時 加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化 同時吹打分散細胞后 移入離心管 離心 除去上清 再加入適量Hanks液 漂洗1次 離心 除去上清 實驗過程 加入2 5ml完全培養(yǎng)液 制成細胞懸液 移2ml完全培養(yǎng)液于青瓶中 再移入0 5mlDMSO 混勻為凍存保護液 然后 滴加 到 的離心管中 混勻制成細胞懸液 分裝到 個凍存管中 液面離管口2mm 擰緊蓋 標記號 將凍存管放入凍存盒 5分鐘后將凍存盒放入 20 冰箱 30分鐘后取出凍存管放入凍存提桶 置液氮罐口 逐漸下降 8分鐘內(nèi)降至液氮面上 2分鐘后沉入液氮中 注意 周四下午進行 復蘇 實驗 實驗過程 觀察培養(yǎng)細胞生長旺盛 即可進行凍存 取培養(yǎng)瓶倒掉培養(yǎng)液 加5mlHanks液 輕洗后倒出 加入3ml消化液 擰緊瓶蓋 平握在手中 消化約10 15分鐘 其間不時輕搖幾次 鏡下觀察細胞變圓 脫落漂動時 加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化 同時吹打分散細胞后 移入離心管 離心 除去上清 再加入適量Hanks液 漂洗1次 離心 除去上清 加入2 5ml完全培養(yǎng)液 制成細胞懸液 移 ml完全培養(yǎng)液于青瓶中 再移入 mlDMSO 混勻為凍存保護液 然后 滴加 到 的離心管中 混勻制成細胞懸液 分裝到 個凍存管中 液面離管口2mm 擰緊蓋 將凍存管放入凍存盒 分鐘后將凍存盒放入 冰箱 分鐘后取出凍存管放入凍存提桶 置液氮罐口 逐漸下降 分鐘內(nèi)降至液氮面上 分鐘后沉入液氮中 實驗十培養(yǎng)細胞的復蘇 使用凍存細胞時 需要進行復蘇 復蘇過程中 復溫速度不當 也可能引起細胞內(nèi)重結(jié)冰 造成細胞損失 復蘇原則是快速融化 1 2min內(nèi)恢復到常溫 以保證細胞外的冰晶快速融化 進入細胞內(nèi)的水分也來不及形成冰晶 復蘇時 保護劑又可促進細胞外水分進入胞內(nèi) 緩解滲透性腫脹引起的細胞損傷 實驗用品 液氮罐 凍存管 40水浴 離心管 1包 完全培養(yǎng)液 培養(yǎng)瓶 2個 1 取出凍存管 立即投入40 溫水中 并充分搖動 使其快速融化 2 將細胞懸液移至含 ml完全培養(yǎng)液的離心管中 離心 棄上清 加入 ml完全培養(yǎng)液 懸浮細胞 移入培養(yǎng)瓶 松蓋入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 1日后 正