MTT配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)11742.doc

MTT配制、原理、操作步驟、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)-一、MTT是什么MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。（可參考Sigma，貨號(hào) M5655， Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）二、MTT法用來做什么 簡單地說：是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法。MTT主要有兩個(gè)用途1藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定；2細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。三、為何MTT可以用來做上述工作檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。Ｋ?、實(shí)驗(yàn)所需材料1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g1.1 對(duì)于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預(yù)先在50ml離心管（沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜?fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計(jì)算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml。1.2 對(duì)于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。注意事項(xiàng)：l 在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。l 配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感l(wèi) MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4度避光保存兩周內(nèi)（個(gè)人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯(cuò)）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用。l MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.2MTT甲瓚溶解液2.1 二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對(duì)人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會(huì)把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。2.2 三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液（文獻(xiàn)方法：周建軍等，評(píng)價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457），該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。（個(gè)人覺得其溶解的能力不如DMSO強(qiáng)）該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。五、MTT法實(shí)驗(yàn)步驟1: 胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10104/ml。細(xì)胞詳細(xì)計(jì)數(shù)方法請(qǐng)參照中的相關(guān)文章。對(duì)于初學(xué)者而言，要使細(xì)胞達(dá)到5-10104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個(gè)簡單的方法以初步確定細(xì)胞數(shù)量。以一般細(xì)胞培養(yǎng)常用的25cm2為例，1) 細(xì)胞密度在長到約80%90%（下圖所示為80%90%密度時(shí)細(xì)胞的大致狀態(tài)），消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻。2) 另取一支新的15ml無菌離心管（為下一步接種96孔板用），裝入約9ml培養(yǎng)基. 3) 從第一步準(zhǔn)備的3ml細(xì)胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)一般為或小于5-10104/ml，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板4個(gè)大格內(nèi)每大格平均5-10個(gè)細(xì)胞（見下圖）；如果不夠該濃度，再根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按50ul計(jì)算。4) 細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2000個(gè)就可以（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2104/ml），細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔500010000個(gè)（相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為5104/ml）。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長較快的細(xì)胞密度可略小。 2將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測(cè)細(xì)胞的密度為500010000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。l 注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對(duì)于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。-3. 將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)6個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。 l 對(duì)于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細(xì)胞死亡。 4. 5%CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細(xì)胞的毒性作用。5. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。 6. 終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。 l 溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用DMSO溶解1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙?jiān)谧烂?，然后?6孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個(gè)人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再?zèng)Q定。2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。 l 另一種方法，用三聯(lián)溶解液（見上面MTT甲瓚溶解液）1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。）2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育46小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測(cè)吸光度。通常37孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會(huì)短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會(huì)長一些。 在實(shí)際的操作過程中，往往為了等待46小時(shí)，使得實(shí)驗(yàn)者在下班以后或者晚上來測(cè)OD值，給實(shí)驗(yàn)者帶來了很大的不方便。個(gè)人曾經(jīng)摸索，加入溶解液后過夜再測(cè)對(duì)OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時(shí)再測(cè)OD值就可以了。7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。六、-MTT結(jié)果分析 關(guān)于如何計(jì)算IC50 1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和Pm:最大陽性反應(yīng)率Pn:最小陽性反應(yīng)率 舉個(gè)例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細(xì)胞后所得MTT值如下藥物濃度ug/ml1005025250OD均值0.080 0.093 -0.236 0.374 0.441 0.531 0.614 公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率抑制率=1-加藥組OD值 -/對(duì)照組OD值，如對(duì)于100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下： 藥物濃度ug/ml100502512.5MTT所有問題大匯總-實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2. 藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。4. 培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的45次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。5. MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。6. 理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。7. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)步驟貼壁細(xì)胞：1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2. 5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況3. 5%CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6. 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1106/ml，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲(chǔ)存液100ug/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1：10-1：20）；需檢測(cè)物10ul；細(xì)胞懸液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ul 1640）。2. 置37，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）4. 離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。5. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。MTT的配制MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長