放射自顯影影像.ppt

本章重點 放射自顯影的定義放射自顯影的基本類型和基本方法放射自顯影的感光材料 一概述 1 定義 放射自顯影 利用射線使感光材料感光形成潛影 經(jīng)顯影定影后形成圖像 判斷放射性示蹤劑的分布部位和數(shù)量 半定量 的技術(shù) 2 放射自顯影的發(fā)展 1867年 鈾鹽可以使銀離子感光 1924年Lacassagne應(yīng)用于研究钚在生物標本中的分布1946年 Belanger和Leblond首次建立現(xiàn)代放射自顯影的方法 3 放射自顯影的優(yōu)點 1 靈敏度高 2 定位準確 能把定位和定量結(jié)合分析3 感光材料具有累積成像的效應(yīng) 所需的放射性物質(zhì)可極微量 4 操作簡單易行 不需要復(fù)雜昂貴的設(shè)備 5 形態(tài) 機能和代謝的綜合分析6 結(jié)果可以長期保存 局限性 1 實驗周期長 2 定量不準確 只能半定量 4 應(yīng)用舉例 藥物 營養(yǎng)物質(zhì) 毒物等在器官 組織 細胞中的分布 運轉(zhuǎn)研究特異性標記前體的參入部位 特點 影響因素標記抗體或藥物在離體標本上進行抗原研究或受體的定位示蹤 二放射自顯影的原理 一 潛影形成的原理 和普通光學(xué)攝影原理相同 利用射線使感光材料感光在標本中放射性存在的原位置出現(xiàn)銀顆粒的沉積 1 電離 釋放電子感光乳膠中每顆溴化銀結(jié)晶由許多AgBr分子組成 制造乳膠時 都使晶體發(fā)生點陣上的缺陷 敏化中心 具有缺陷的晶格排列 完整的晶格排列 當核射線作用于溴化銀結(jié)晶時 使某些分子電離射出電子 向敏化中心移動形成陰電層 AgBr Ag Br e 2 Ag 離子向敏化中心移動 Ag 離子向敏化中心移動 與電子結(jié)合 即射出的電子被帶正電荷的銀離子俘獲 形成銀原子 Ag e Ag 3 形成潛影許多帶正電荷的銀離子被顯影劑還原成銀原子 在該溴化銀結(jié)晶顆粒中形成潛影 二 潛影的消退 已經(jīng)還原的銀原子在水 氧的作用下重新變成離子 使已經(jīng)形成的潛影消退 放射自顯影的曝光過程應(yīng)在干燥 低溫或充氮氣的環(huán)境下進行 三 顯影和定影 顯影液將銀離子還原成銀顆粒的過程顯影液 顯影劑 促進劑 保護劑 抑制劑顯影劑 還原作用 米吐爾 海德爾促進劑 提供堿性環(huán)境 增加顯影作用 常用碳酸鈉保護劑 中和還原產(chǎn)物 亞硫酸鈉抑制劑 抑制未形成潛影的銀鹽分解 溴化鉀 定影 定影液溶解未形成潛影的銀晶體 定影液 定影劑 保護劑 停顯劑 堅膜劑定影劑 溶解銀晶體 海波保護劑 抑制定影劑被酸分解 亞硫酸鈉停顯劑 終止顯影液的繼續(xù)作用 醋酸堅膜劑 防止乳膠膨脹 脫落 擦傷 鉀礬 三放射自顯影的材料 一 感光材料 1 組成由銀鹽和明膠組成 銀鹽多為鹵化銀 如溴化銀 明膠主要起支持作用 吸水膨脹后具有通透性 2 分類 1 原子核乳膠 溴化銀和明膠按照一定的比例混勻制備而成 常溫下呈粘稠液狀 低溫下則為膠凍狀 溫度升至40 左右時為液態(tài) 可以根據(jù)使用需要制備成各種形態(tài) 液體核乳膠 由溴化銀和明膠按照80 20的比例混合制備 可制備成不同形狀和厚度 核乳膠干板 核乳膠膠片 揭膜核乳膠 中國原子能科學(xué)研究院物理生產(chǎn)的核乳膠 2 氚片 由溴化銀 碘化銀和明膠組成 銀晶體顆粒平均直徑為1 m單面涂膠主要用于3H標記化合物的自顯影 3 X線片 由溴化銀 碘化銀和明膠組成 銀晶體顆粒平均直徑為2 5 m雙面或單面涂膠主要用于射線能量較高的宏觀自顯影 4 自顯影增強劑 在感光材料里面加入熒光材料或?qū)晒獠牧现谱鞒杀∧じ采w在凝膠表面 感光材料在射線和光子的雙重作用下面感光 可以縮短實驗周期 暗盒和增強屏 5 磷屏成像 用可重復(fù)使用的磷屏作為成像板專門的讀出裝置 計算機磷屏成像系統(tǒng) 優(yōu)點 可用于多種核素的宏觀自顯影操作簡便不需膠片和顯影定影等照相處理步驟磷屏可以重復(fù)使用缺點 分辨率較低目前還不能用于高倍光鏡和電鏡自顯影儀器價格比較昂貴 二 放射自顯影中常用的放射性核素 應(yīng)考慮其射線的種類 能量和半衰期 3H 14C 35S 45Ca 32P 33P 131I 125I 99mTc等 發(fā)射 射線的核素毒性都較大 一般不用于示蹤研究 單純的發(fā)射 射線的放射性核素 難于在乳膠中形成潛影 自顯影效果差 放射自顯影常用的放射性核素 四放射自顯影的基本技術(shù)和方法 一 主要類型 宏觀自顯影 整體水平光鏡自顯影 細胞水平電鏡自顯影 亞細胞水平 1 宏觀自顯影 常用肉眼 放大鏡或低倍顯微鏡觀察用灰度或黑度對比來判斷示蹤劑的部位和數(shù)量優(yōu)點是可以同時觀察各臟器 組織中放射性示蹤劑的分布 多用于小動物的整體標本 大動物的臟器或肢體 以及各種電泳譜 色譜和免疫沉淀板等的示蹤研究 小鼠頭部的宏觀自顯影 凝膠電泳的自顯影結(jié)果 核酸電泳展開板的放射自顯影 2 光鏡自顯影 以光學(xué)顯微鏡為工具進行觀察 以鏡下的銀顆粒分布及數(shù)量來判斷放射性核素示蹤劑的部位和數(shù)量 鏡下的銀顆粒為黑色或深棕色的小圓點適用于冰凍組織切片 石蠟組織切片 血細胞涂片 骨髓細胞涂片等標本的示蹤研究 放射自顯影檢測寄生蟲感染中的脾細胞 3 電鏡自顯影 以電子顯微鏡觀察 以電鏡下銀顆粒的分布及數(shù)量來判斷 電鏡下電子軌跡為蛇樣扭曲適用于細胞超微結(jié)構(gòu)上的精確定位和定量 蛇毒素與乙酰膽堿受體結(jié)合 二 基本方法 1 基本步驟 示蹤 向?qū)嶒瀯游矬w內(nèi)或離體標本上引入放射性核素標記物 標本制備 取生物標本并制備成含放射性核素的切片 涂片 自顯影制備 暗室中在制備的標本上敷加感光材料 曝射 避光條件下核射線作用于感光乳膠 照相處理 顯影 定影 水洗 干燥 染色 封固 閱讀分析 2 示蹤劑引入的方法 體內(nèi)實驗 可由靜脈 皮下 肌肉 腹腔注射或直接腦內(nèi)注射和灌胃等途徑給入放射性標記化合物 體外實驗 可在培養(yǎng)瓶中給入 或?qū)⑹聚檮┲苯蛹釉谇衅线M行結(jié)合反應(yīng) 洗去多余的示蹤劑后再進行自顯影實驗 3 標本制備 組織切片 冰凍切片 石蠟切片 整體動物切片 專用整體動物切片機上制成 牙齒 骨骼 制備磨片 體液 細胞 制備涂片 電鏡標本 超薄切片機 其它 電泳條 層析條等可干燥后使用 4 自顯影片的制備方法 液體乳膠浸膜法 在暗室中將液體核乳膠置37 40 水浴融化 玻棒攪拌15min至均勻 將載玻片帶標本的插入乳膠內(nèi) 浸沾乳膠 約0 5min后緩慢勻速地垂直提出 干燥過夜 在有干燥劑的暗盒內(nèi) 密封置4 曝射 然后顯影 定影 染色 封固等則在自顯影結(jié)束后進行 接觸法 將樣品擺放在合適的載波片上 取與載波片大小相同的核乳膠干板覆蓋在載波片上 用橡皮筋固定 外面包上黑紙 然后4度密封保存充分曝光 注意 接觸松緊要適當以免引起擠壓效應(yīng) 接觸法示意圖 濕貼法 暗室中將冰凍切片直接貼在干板的乳膠面 冷凍干燥后曝射 揭膜法 將核乳膠制備成核乳膠揭膜 懸浮于液體中 用固定好樣品的載波片在液體中撈取揭膜 使揭膜覆蓋在樣品上 金屬環(huán)法 電鏡自顯影在暗室內(nèi)融化乳膠 按說明書要求稀釋 降溫至25 用不銹鋼制成的金屬環(huán) 直徑4毫米 插入乳膠液中 輕輕垂直提取 金屬環(huán)上即形成單層乳膠膜 將環(huán)套在載有超薄切片的鋪有火棉膠的銅網(wǎng)上 單層乳膠膜即覆蓋在切片表面 曝射后顯影定影 干燥后即可在電鏡下觀察 5 曝射放射自顯影的曝光時間與所使用的放射性核素種類有關(guān) 125I需要感光48小時以上 14C要數(shù)天 幾周 3H要10天以上 1 2個月 6 顯像處理 顯影 18 20 2 4min定影 18 20 8 15min水洗 清除殘余顯影 定影劑 20min以上7 干燥 染色和封固 干燥箱干燥常規(guī)蘇木素