免疫組化標(biāo)準(zhǔn)方案.docx

免疫組化標(biāo)準(zhǔn)方案 （福爾馬林固定石蠟包埋）1. 實(shí)驗(yàn)材料(1) PBS(2) Clearing and rehydration試劑：Histoclear II、100%、90%和70% 酒精(3) 熱誘導(dǎo)表位恢復(fù)試劑試劑（Heat induced epitope retrieval; HIER）：10mM檸檬酸鈉，PH6.0(4) 抗原恢復(fù)試劑（Antigen retrieval）：蛋白酶K和胰蛋白酶(5) 內(nèi)源性過氧化酶封閉液：0.3%H2O2(6) 封閉液：含10%FBS的PBS，F(xiàn)BS種屬與二抗來源種屬一致(7) 一抗：純化或生物素化規(guī)格（供二步法使用）(8) 二抗：生物素化。（供三步法用）(9) 放大劑：抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶（cat#18-4100）(10) 顯色劑:30% H2O2儲液，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）1%儲液。(11) 細(xì)胞核復(fù)染試劑：蘇木素（Hematoxylin）(12) 包埋劑：封蓋膠（Fisher Scientific）2. 實(shí)驗(yàn)方案(1) 石蠟包埋，切片。(2) 50-60度烤箱中干燥烘烤20分鐘（注意：溫度不能超過60度以免破壞靶抗原）。(3) 對載玻片進(jìn)行如下洗滌和孵育程序，以除去石蠟和水化：Histoclear II 3 x 5 分鐘, 100% Ethanol 2 x 5 分鐘, 90% Ethanol 1 x 5 分鐘, 70% Ethanol 1 x 5 分鐘, ddH2O 1 x 5 分鐘（注意：充分浸入，除去氣泡，避免組織過分干燥以免影響后續(xù)染色）。注：若抗原在固定時容易交聯(lián)（影響一抗的特異性），則需要蛋白酶消化或枸櫞酸鹽緩沖液中加熱除去交聯(lián)?？乖迯?fù)方法依照靶抗原選擇，建議沒有修復(fù)的和修復(fù)后的抗原同時進(jìn)行。(4) （可選）熱修復(fù)抗原表位（HIER）：將玻片完全浸沒于修復(fù)液中，微波加熱煮沸15min，再置于枸櫞酸鹽緩沖液中冷卻至室溫。(5) （可選）抗原修復(fù)（蛋白消化法）：將玻片浸入蛋白酶K或胰蛋白酶中，37度孵育20min，冷卻至室溫。(6) 用 PBS小心洗滌兩次，每次5分鐘，浸沒，低速搖晃。(7) 如果最后要使用過氧化物酶顯影，則將玻片浸入0.3%H2O2中室溫15-40min，除去過氧化物酶。注意：個別組織孵育時間依照過氧化物酶含量調(diào)整。(8) 用 PBS小心洗滌三次，每次5分鐘，浸沒，低速搖晃。(9) 用10%的正常血清封閉組織上非特異性位點(diǎn)，100-150ul/slide，室溫封閉1小時，為防止封閉液蒸發(fā)，可以使用石蠟封口膜輕輕覆蓋切片，避免拉伸和產(chǎn)生氣