DNA的粗提取和鑒定.ppt

DNA的粗提取和鑒定 目的要求 1 了解從細(xì)胞中提取DNA的基本原理2 初步掌握DNA的粗提取和鑒定的方法3 觀察提取出來的DNA 實驗思路 1 DNA從哪提取 2 怎樣將DNA與細(xì)胞中的其他物質(zhì)分離 3 怎樣鑒定我們提取的DNA 實驗原理 1 DNA在NaCl溶液中的溶解度 是隨著NaCl的濃度的變化而改變的 當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0 14mol L時 DNA的溶解度最低 利用這一原理 可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出 2 DNA不溶于酒精溶液 但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液 利用這一原理 可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA 3 DNA遇二苯胺 沸水浴 會染成藍(lán)色 因此 二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑 實驗材料和用具 實驗材料 1 雞血細(xì)胞液 5 10ml 2 體積分?jǐn)?shù)為95 的冷酒精溶液 實驗前置于冰箱內(nèi)冷卻24h 3 蒸餾水 4 質(zhì)量濃度為0 g ml的檸檬酸鈉溶液 抗凝劑 5 物質(zhì)的量濃度分別為2mol L和0 015mol L的NaCl溶液 6 二苯胺試劑 實驗用具 鐵架臺 鐵環(huán) 鑷子 三角架 酒精燈 石棉網(wǎng) 載玻片 玻璃棒 濾紙 滴管 量筒 100ml 一個 燒杯 100ml 一個 50ml 500ml各二個 試管 20ml 二個 漏斗 試管夾 紗布 二 DNA的粗提取與鑒定的實驗設(shè)計 一 實驗材料的選取 材料 新鮮的雞血 注意 本實驗中 要往雞血中加入抗凝劑 檸檬酸鈉溶液 原則上只要含DNA的生物材料都可以 但是選取DNA含量相對較高的生物組織 成功率更大 1 先將新鮮的雞血離心 獲得雞血細(xì)胞 2 在雞血細(xì)胞中加入一定量的蒸餾水 同時用玻璃棒攪拌 過濾后收集濾液即可 二 破碎細(xì)胞 獲取含DNA的濾液 1 破碎細(xì)胞 討論 為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂 利用了什么原理 2 過濾 獲取含DNA的濾液 三 去除濾液中的雜質(zhì) 為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理 討論 此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分 答 可能含有核蛋白和RNA等雜質(zhì) 討論 為什么反復(fù)地溶解與析出DNA 能夠去除雜質(zhì) 答 用高鹽濃度的溶液溶解DNA 能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì) 用低鹽濃度使DNA析出 能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì) 因此 通過反復(fù)溶解與析出DNA 就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì) 四 DNA的析出與鑒定 DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液 體積分?jǐn)?shù)為95 靜置2 3min 溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物 這就是粗提取DNA 用玻璃棒沿一個方向攪拌 卷起絲狀物 并用濾紙吸取上面的水 1 DNA的析出 2 DNA的鑒定 鑒定DNA時在試管中先加入物質(zhì)的量的濃度為2mol L的NaCl溶液5ml于兩只試管中 其中一只加入DNA絲狀物 各加入二苯胺4ml試劑 混合均勻后 將試管置于沸水中加熱5min 待試管冷卻后 比較兩只試管中溶液顏色的變化 看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色 一 案例一 以雞血為實驗材料進(jìn)行DNA的粗提取 三 實驗案例 用動物肝臟細(xì)胞作實驗材料常常需要勻漿和離心 對設(shè)備要求較高 操作繁瑣 歷時較長 1 雞血細(xì)胞做實驗材料的原因 雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富 材料易得 4 課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液 取質(zhì)量濃度為0 1g ml的檸檬酸納溶液 抗凝劑 100ml 置于500ml燒杯中 注入新鮮的雞血 約180ml 同時用玻璃棒攪拌 使血液與檸檬酸納溶液充分混合 以免凝血 將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi) 精置一天 使血細(xì)胞自行沉淀 也可以將血液倒入離心管內(nèi) 用1000r min 轉(zhuǎn)每分 的離心機(jī)離心2min 血細(xì)胞沉淀于離心管底部 實驗時 用吸管除去離心管上部的澄清液 就可以得到雞血細(xì)胞液 過程 檸檬酸鈉作用 防止血液凝固 作用機(jī)理 檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2 發(fā)生反應(yīng) 生成檸檬酸鈣絡(luò)合物 血漿中游離的Ca2 大大減少 血液就不會凝固 雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA 容易被玻璃容器吸附 所以在提取過程中為了減少DNA的損失 最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液 注意事項 討論 提取雞血中的DNA時 為什么除去血液中的上清液 答 血液分為兩部分 一部分是血漿 一部分是血細(xì)胞 離心后除去的上清液是血漿 5 方法步驟 將制備好的雞血細(xì)胞液5mL 10mL 注入到50mL燒杯中 向燒杯中加入蒸餾水20mL 同時用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min 使血細(xì)胞加速破裂 然后 用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至500mL 取其濾液 提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì) 討論 答 讓細(xì)胞內(nèi)濃度大于周圍溶液的濃度 細(xì)胞會吸水以至脹破 1 為什么要加入蒸餾水 加入蒸餾水后細(xì)胞會有什么變化 2 用玻璃棒攪拌有什么意義 答 用玻璃棒攪拌可以加速血細(xì)胞和細(xì)胞核的破裂 注意應(yīng)沿一個方向快速攪拌 但也不能太快太猛 防止打碎DNA 3 濾去的是什么物質(zhì) 得到的是什么 答 過濾將濾去的是細(xì)胞膜和核膜等物質(zhì) 得到的是與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合在一起的DNA 溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol的溶40mL加入到濾液中 并用玻璃棒沿一個方向攪拌1min 使其混合均勻 這時DNA在溶液中呈溶解狀態(tài) 沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水 同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌 這時燒杯中有絲狀物出現(xiàn) 注意觀察絲狀物呈什么顏色 繼續(xù)加入蒸餾水 溶液中出現(xiàn)的粘稠物會越來越多 當(dāng)粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水 這時溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0 14mol L 析出含DNA的粘稠物 討論 加入蒸餾水的目的 降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度最低點 使DNA從NaCl溶液中析出 將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離 這一步驟是實驗成敗的關(guān)鍵 實驗中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水 并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌 以利于DNA分子的附著和纏繞 注意事項 濾取含DNA的粘稠物 用放有多層紗布的漏斗 過濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中 含DNA的粘稠物被留在紗布上 將DNA的粘稠物再溶解 取1個50mL燒杯 向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol L的溶液20mL 用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中 用玻璃擇不停地攪拌 使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中 過濾含有DNA的氯化鈉溶液 取1個100mL燒杯 用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液 取其濾液 DNA溶于濾液中 提取含雜質(zhì)較少的DNA 在上述濾過的溶液中 加入冷卻的 酒精的體積分?jǐn)?shù)為95 的溶液50mL 使用冷卻的酒精 對DNA的凝集效果較佳 并用玻璃棒攪拌 溶液中會出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物 用玻璃棒將絲狀物卷起 并用濾紙吸取上面的水分 這種絲狀物的主要成分就是DNA 答 因為DNA不溶于冷酒精 而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中 使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出 懸浮于溶液中 討論 2 觀察絲狀物呈什么顏色 答 白色 1 為什么要加50mL的冷酒精 取兩支20mL的試管 各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0 015mol L的溶液5mL 將絲狀物放入其中一支試管中 用玻璃棒攪拌 使絲狀物溶解 然后 向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑 混合均勻后 將試管置于沸水中加熱5min 待試管冷卻后 觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化 DNA的鑒定 討論 答 有絲狀物的試管變成藍(lán)色 另一試管還是原來顏色 2 這一鑒定結(jié)果說明什么問題 1 比較兩個試管中溶液的顏色有什么不同 答 提取出的絲狀物是DNA 3 DNA的直徑約為20 10 10m 實驗中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個DNA分子直徑的大小 答 DNA分子直徑只有2nm 絲狀物是多個DNA子聚在一起形成的 答 整個實驗共 兩次蒸餾水 三次過濾 兩次析出 六次攪拌 6 討論 兩次蒸餾水 第一次 細(xì)胞吸水脹破第一步第二次 使DNA黏稠物析出第三步 1 此實驗過程中有幾次使用蒸餾水 幾次過濾 幾次析出 幾次攪拌 分別在哪一步 過濾時使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān) 第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān) 所以要使用多層紗布 第一次和第三次均要用其濾液 使用的紗布為1 2層 三次過濾 第一次 DNA存在于濾液里第一步第二次 DNA被留在紗布上第四步第三次 DNA存在于濾液里第六步 兩次析出 第一次 用0 14mol L的NaCI溶液含雜質(zhì)多 第三步 第二次 用冷卻的95 的酒精 第七步 六次攪拌 第一 二 三 五 七步 其中除第八步外 其余均要朝一個方向攪拌 在第三 五步攪動還要輕緩 玻璃棒不要直插燒杯底部 這樣才能保證得到完整的DNA 討論 方案二與方案三的原理有什么不同 答 方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白 從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開 方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同 從而使蛋白質(zhì)變性 與DNA分離方案二利用了酶的專一性 方案三利用了DNA的穩(wěn)定性 5分鐘內(nèi)做出自己的DNA 材料 萃取出DNA的材料 人 含有SDS的清潔劑 幾乎大部分都有 食鹽水嫩精 木瓜酵素papain 筷子吸管透明杯子95 酒精 5分鐘內(nèi)做出自己的DNA 方法 1 95 酒精放在冰箱備用 2 緩衝液 120ml的水 1又1 4茶匙