環(huán)境工程微生物學實驗八細菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術.doc

南昌大學實驗報告學生姓名： 學 號： 專業(yè)班級： 實驗類型： 驗證 綜合 設計 創(chuàng)新 實驗日期： 實驗成績： 實驗八 細菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術一、實驗目的：1、學習從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分離、培養(yǎng)微生物，掌握一些常用的分離和純化微生物的方法；2、 學會幾種接種技術。二、實驗基本原理：自然界中的微生物總是雜居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存著多種微生物。要研究其中的某一種微生物，首先必須將它分離出來。受污染的土壤或水體中，微生物的數(shù)量和污染物的降解之間存在著顯著的關系.為了提高污染物降解速率,常需接種一些能降解目標污染物的高效菌。從經(jīng)過富集、馴化培養(yǎng)的樣品中篩選目標菌株，往往是獲得高效降解菌的有效方法。根據(jù)目標微生物特定的營養(yǎng)要求，設計相應的選擇培養(yǎng)基。是快速高效獲得目標菌的關鍵步驟。土壤是微生物生活的大本營，有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱，同其他生物環(huán)境相比它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化的到許多有價值的菌株，事實上，生產(chǎn)、工程上很多有益菌株都是從土壤中分離得到的。從復雜的微生物群體中獲得只含有一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。微生物純種分類的方法有很多，常用的方法有兩類一類是單細胞挑取法，采用這種方法能獲得微生物的克隆純種，但對儀器條件要求較高，一般實驗室不能進行。另一類是單菌落分離（平板分離法），該方法簡便是微生物學實驗中常采用的的方法。通過形成單菌落獲得純種的方法有平板劃線法、平板澆注（稀釋混合平板法）、平板表面涂布法。此次實驗采取的是平板分離法，該方法操作簡單，普遍用于微生物的分離與純化。其原理包括兩方面：1、在適合于待分離微生物的生長條件下（如營養(yǎng)、酸堿度、溫度與氧等）培養(yǎng)微生物，或加入某種抑制劑造成只利于待分離微生物的生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。2、微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得純培養(yǎng)。 但是從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落的特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定。有的微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。三、主要儀器設備及耗材：1.器材：培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、普通光學顯微鏡、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、電爐、玻璃棒、接種環(huán)、鑷子、搪瓷杯、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、移液槍（槍頭）、電子天平、濾紙、pH試紙等。2.試劑：配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的原料（牛肉膏、NaCl、瓊脂、蛋白胨）、結(jié)晶紫染液、番紅染液、碘液、95乙醇、5孔雀綠染液、0.5番紅水染液、3過氧化氫水溶液、蒸餾水等。3.土樣：學生自主實時選擇土樣，地表10cm左右。四、實驗步驟：1、玻璃器皿的準備玻璃器皿在實驗前必須洗滌干凈，根據(jù)實驗要求準備相應數(shù)量，移液管、培養(yǎng)皿等包裝好后滅菌?？刹捎酶蔁釡缇ㄌ幚?。2、配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：配方： 牛肉膏 0.3% 1.5 g 蛋白胨 1% 5g NaCl 0.5% 2.5g 瓊脂 2% 10g pH 7.07.2 水 500ml配制好的培養(yǎng)基分裝好后，必須馬上進行滅菌處理（高壓蒸汽法）。3、準備稀釋水 稀釋水也必須滅菌，可與培養(yǎng)基滅菌一起進行。4、制備土壤稀釋液：稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水的帶有玻璃珠的三角瓶中，入振蕩培養(yǎng)箱中振蕩搖勻20min，使土樣和水充分混合，取1支1ml無菌移液管從三角瓶中吸取1ml（此操作要求無菌操作），加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推分別制成制成0.01、0.001、0.0001等不同稀釋度的土壤溶液。稀釋過程如圖1示：(同學們不必畫圖)土壤樣品土壤樣品圖1 稀釋過程示意圖 5.平板分離法分離澆注平板法（稀釋混合平板法）分別取上述不同稀釋液少許（0.51ml），與已熔化并冷卻至50左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。平板劃線分離 將已經(jīng)熔化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制成平板，用接種環(huán)沾取少量待分離的材料，在培養(yǎng)基表面平行或分區(qū)劃線，然后，將培養(yǎng)皿放入恒溫箱里培養(yǎng)。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成純種的單個菌落。劃線法特點：快速、方便。注意：分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品），連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）。（同學們不必畫圖)）圖2 劃線法分離示意圖涂布平板法 由于將含菌材料先加到還較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒人無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在