液相色譜儀工作原理 液相色譜概述01.doc

液相色譜儀工作原理 液相色譜概述01 2009-09-02 18:44:46| 分類： 分析儀器 | 標(biāo)簽：色譜優(yōu)化 e名京人 液色迷人 液相色譜專家|字號大中小訂閱島津shimadzu 的液相色譜概述01 液色迷人 的液相色譜概述01液相色譜儀工作原理 一、液相色譜儀高壓輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)由貯液罐、過濾器、梯度洗脫裝置、高壓輸液泵、脫氣裝置等組成。高壓泵是高效液相色譜儀最重要的部件之一。由于高效液相色譜儀所用色譜柱直徑細(xì)，固定相粒度小，流動相阻力大，因此，必須借助于高壓泵使流動相以較快的速度流過色譜這。高壓泵需要滿足以下條件：能提供150450kg/cm2的壓強；流速穩(wěn)定，流量可以調(diào)節(jié)；耐腐蝕。目前所用的高壓泵有機械泵和氣動放大泵兩種。梯度淋洗裝置可以將兩種或兩種以上的不同極性溶劑，按一定程序連續(xù)改變組成，以達(dá)到提高分離效果，縮短分離時間的目的。梯度淋洗的作用與氣相色譜中的程序升溫裝置類似。（一）貯液罐貯液罐為不銹鋼、玻璃或氟塑料制成的容器，容量為1到2 L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動相。貯液罐可以是一個普通的溶劑瓶，也可以是一個專門設(shè)計的儲液器。儲液器往往和泵通過管路構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)以便除去溶劑中的氣體。現(xiàn)多數(shù)使用溶劑瓶，一般采用耐腐蝕的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。貯液罐的放置位置要高于泵體，以保持輸液靜壓差，使用過程應(yīng)密閉，以防止因蒸發(fā)引起流動相組成改變，還可防止氣體進(jìn)入。（二）高壓輸液泵氣相色譜由高壓鋼瓶直接提供動力，高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，是流動相的動力源。高壓輸液泵功能是將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。液相色譜為了獲得高柱效，所用色譜柱徑較細(xì)，所填固定相粒度很小，因此，對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓輸液泵。1.對高壓輸液泵的要求（1）能在高壓下連續(xù)工作，一般要求耐壓4050MPacm2，能在824 h連續(xù)工作。（2）輸出流量范圍寬：分析型填充柱在0.1-10mL/min內(nèi)連續(xù)調(diào)節(jié)，制備型填充柱要求在100mL以上。（3）輸出流量穩(wěn)定，要求無脈沖，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。（4）耐腐蝕，能適合各種有機溶劑、水和緩沖溶液。（5）密封性好。泵體易于清洗和維修。高壓輸液泵，按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。2泵的類型高壓輸液泵主要有恒壓泵和恒流泵兩類，常使用恒流泵。恒流泵又稱機械泵，主要有機械注射泵與機械往復(fù)泵兩類。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定，其流量與流動相粘度和色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指輸出壓力恒定，但其流量隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重現(xiàn)性差。如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。恒壓泵和恒流泵各有優(yōu)缺點。（1）恒壓泵A：氣動泵直接式，簡單，但高壓氣體可溶解于溶劑中，當(dāng)溶劑進(jìn)入檢測器時會放出氣體影響檢測。 圖8-7 氣動泵B：氣動放大泵泵出口壓力在系統(tǒng)中是恒定的，流速由柱的阻力決定。壓力由兩活塞的面積比決定。操作簡便，流量范圍大，但流速取決于溶劑粘度和柱滲透性。液缸大不便清洗。流量有波動。 圖8-8 氣動放大泵特點：高壓、無脈動、成本低，用空氣壓縮機或氣體鋼瓶低壓驅(qū)動，操作成本低。缺點是更換溶劑困難。（2）恒流泵恒流泵有往復(fù)泵和螺旋柱塞泵，這類泵輸出流量恒定，柱壓力由柱的阻力決定。A：螺旋注射泵步進(jìn)馬達(dá)控制活塞移動，同時控制流量。至限位開關(guān)時停泵后退活塞、吸液，然后繼續(xù)。壓力大（可達(dá)60 MPa），無脈沖。但清洗不便，精密而價高。 圖8-9 螺旋注射泵B：往復(fù)柱塞泵圖8-10 往復(fù)柱塞泵往復(fù)柱塞泵由偏心輪帶動活塞往復(fù)移動，恒流輸出，并通過改變電機轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)流量。體積小清洗方便，特別適用于梯度淋洗。往復(fù)柱塞泵有明顯脈沖，需采取增加脈沖阻尼器、改變凸輪形狀、加電子線路保護(hù)、用多頭泵系統(tǒng)(并聯(lián)串聯(lián))等措施。往復(fù)柱塞泵目前應(yīng)用較多。往復(fù)柱塞泵特點是單位時間輸出的液體流量由單位時間柱塞往復(fù)的次數(shù)決定，因此，流量恒定，與系統(tǒng)阻力無關(guān)，可以連續(xù)不斷的輸送液體，更換溶劑方便，可用于梯度洗脫，主要缺點是有脈動。C：多頭柱塞泵并聯(lián)雙柱泵少用一組單向閥。用兩相差180度的凸輪推動兩交替工作的柱塞。流量穩(wěn)定。 圖8-11 多頭柱塞泵D：往復(fù)隔膜泵柱室間用不銹鋼薄膜隔開而使活塞不與流動相接觸，靠油壓迫鋼膜而輸出。流量穩(wěn)定，單形成高壓慢。 圖8-12 往復(fù)隔膜泵（三） 輸液體統(tǒng)的輔助裝置1過濾器：除掉機械雜質(zhì)及固體顆粒。由于液相色譜柱、進(jìn)樣器等都很精密，微小的機械雜質(zhì)將導(dǎo)致這些部件的損害，而不能正常工作，同時機械雜質(zhì)在柱頭的積累還影響柱子的使用，因此，溶劑需要過濾。圖8-13 過濾器的結(jié)構(gòu)2混合器：體積不宜大。3脈動阻尼器：種類多，都有一定容積和彈性。4壓力測量裝置：電子壓力控制器流量5流量測量裝置：電子流量計6脫氣裝置：除掉溶于流動相中的各類氣體，以保證柱效能。可采用通氮脫氣、超聲波脫氣、自動脫氣機脫氣等。（四）梯度洗脫裝置在液相色譜中，當(dāng)樣品組成復(fù)雜時，有時會出現(xiàn)先出的峰分不開，后面的峰保留值又太大的現(xiàn)象，這時，可以采用梯度洗脫來調(diào)整混合溶劑的組成，改變?nèi)軇姸然蜻x擇性。梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：1外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺泵即可。2內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度），先將兩種溶劑分別用泵增壓后，再由泵按程序壓入混合室，混合，再注入色譜柱。 圖8-14 梯度洗脫裝置示意圖梯度洗脫的實質(zhì)是通過不斷地變化流動相的強度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過流動相的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。流動相A、洗脫時，若樣品中各成分容量因子k相差大，則大的峰寬而低且分析時間長。流動相B、是溶解力強。洗脫時，各成分很快出來，則k(12)小的峰達(dá)不到分離。AB 若將A、B流動相的組成隨時間改變，則即分離好，又縮短分析時間。當(dāng)我們需要混合三種流動相時，可利用電磁閥的功能將吸液分劃成ABC三部分，劃分比一定，組分送液時是一定時，相當(dāng)于GC中恒溫分析。在梯度送液時，劃分比則按所設(shè)定的程度時時刻刻都在變化，相當(dāng)于GC中程序升溫。二、液相色譜儀進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約540 cm），因此柱外效應(yīng)較突出。柱外效應(yīng)是指色譜柱外因素引起的峰展寬，包括進(jìn)樣系統(tǒng)，連接管，檢測器中存在的死體積。柱外展寬可分為柱前和柱后展寬，進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。在液相色譜中，進(jìn)樣方式有隔膜式注射進(jìn)樣器進(jìn)樣，高壓進(jìn)樣閥進(jìn)樣，自動進(jìn)樣裝置等。（一）隔膜式注射進(jìn)樣器隔膜式注射進(jìn)樣器有硅橡膠隔膜，在原理上與氣相色譜法完全一致。用微量注射器進(jìn)樣的優(yōu)點可柱頭進(jìn)樣，減小死體積，充分發(fā)揮柱的效能，簡單便宜。缺點是高壓進(jìn)樣時漏液會產(chǎn)生誤差，隔墊使用次數(shù)有限，進(jìn)樣量小，重復(fù)性差。（二）進(jìn)樣閥方式六通閥進(jìn)樣目前，廣泛采用多通路進(jìn)樣閥，它可以承受很高的壓力，由于進(jìn)樣量是由進(jìn)樣定量管決定的，因此，可以獲得好的重復(fù)性，更換不同體積的進(jìn)樣定量管，可調(diào)整進(jìn)樣量。進(jìn)樣時，樣品中不應(yīng)混入機械雜質(zhì)，溶解樣品的溶劑最好與使用的流動相相同，以防止溶劑變化出現(xiàn)不溶物而堵塞柱子。一般高效液相色譜流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，六通閥結(jié)構(gòu)如圖所示，進(jìn)樣量由定量環(huán)確定。操作時先將進(jìn)樣器手柄置于采樣位置（LOAD），此時進(jìn)樣口只與定量環(huán)接通，處于常壓狀態(tài)，用微量注射器（體積應(yīng)大于定量環(huán)體積）注入樣品溶液，樣品停留在定量環(huán)中。然后轉(zhuǎn)動手柄至進(jìn)樣位置（INJECT），使定量環(huán)接入輸液管路，由高壓泵輸送的流動相將樣品送人色譜柱中。樣品定量管的容積是固定的，因此進(jìn)樣重復(fù)性好。缺點是不能注入小體積樣品（1.2L）,改變注入量時要更換定量管。 圖8-15旋轉(zhuǎn)式六通閥進(jìn)樣裝置三、液相色譜儀分離系統(tǒng)(一) 色譜柱分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。進(jìn)行色譜分離的首要工作是選擇性能良好的色譜柱，即選擇在確定的分離條件下分離效率高和分析時間短的色譜柱。色譜柱的選擇應(yīng)考慮：固定相類型的選擇, 主要取決于樣品分離模式； 柱填料的結(jié)構(gòu), 主要指顆粒的形狀大小、均勻性、比表面、平均孔徑和孔容等； 柱規(guī)格指柱內(nèi)徑、柱長度和填料粒度；色譜柱的牌號/廠商。色譜柱多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱可分為分析柱；制備柱；分析柱的保護(hù)柱。1柱材料及規(guī)格色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多,它是由內(nèi)部拋光的不銹鋼管制成。一般色譜柱長540cm，內(nèi)徑為16 mm，柱效達(dá)500010000塊/m理論塔板數(shù)。凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm。，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。2柱的填料固定液涂在擔(dān)體上而成。擔(dān)體有兩類：一類是表面多孔型擔(dān)體；另一類是全多孔型擔(dān)體。近年來又出現(xiàn)了全多孔型微粒擔(dān)體,這種擔(dān)體粒度為510m，是由10 nm級的硅膠微粒堆積而成，又叫堆積硅珠。由于顆粒小，所以柱效高，是目前最廣泛使用的一種擔(dān)體。3保護(hù)柱一般在分離柱前有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱一樣，安裝在分析柱前。其作用是收集、阻斷來自進(jìn)樣器的機械和化學(xué)雜質(zhì)，以保護(hù)和延長分析柱的使用壽命。一只1cm長的保護(hù)柱就能提供充分的保護(hù)作用。若選用較長的保護(hù)柱，雖可降低污染物進(jìn)入色譜柱，但會引起譜帶擴張。因此選擇保護(hù)柱的原則是在滿足分離要求的前提下，盡可能選擇對分離樣品保留低的短保護(hù)柱。保護(hù)柱也可裝填和分析柱不同的填料，如較粗顆粒的硅膠（1015m）。保護(hù)柱裝填的填料較少，價格較低，為消耗品，通常分析50100次樣品，柱壓力呈增大趨向時就是需要更換保護(hù)柱的信號。目前市場上供應(yīng)的結(jié)構(gòu)新穎的可更換芯式設(shè)計保護(hù)柱，是由保護(hù)套和可更換式保護(hù)芯，兩部分組成。(二) 柱連接方式柱出、入口的連接管的死體積越小越好,一般常用窄孔(內(nèi)徑0.13mm)的厚壁(1.52.0mm)不銹鋼管,以減少柱外死體積. (三) 柱溫控制在高效液相色譜分析中，柱溫一般為室溫或接近室溫。適當(dāng)提高柱溫可改善傳質(zhì)，提高柱效，縮短分析時間。因此，在分析時可以采用帶有恒溫加熱系統(tǒng)的金屬夾套來保持色譜柱的溫度。溫度可以在室溫到60之間調(diào)節(jié)。對凝膠滲透色譜儀，其柱溫可從室溫至150實現(xiàn)精確控制。四、液相色譜儀檢測系統(tǒng)檢測器實際上是一種換能裝置，它將流動相中組分含量的變化，轉(zhuǎn)變成可測量的電信號(通常是電壓)，然后輸入記錄器。從原理分析，任何一種分析鑒定方法都可能用作色譜檢測器。理想的檢測器應(yīng)該是靈敏度高、線性范圍大、對所有待測組分相同響應(yīng)。高效液相色譜的檢測器很多，光學(xué)(紫外,熒光,折光檢測器)；電化學(xué)(極譜、電導(dǎo)、庫侖、離子選擇電極)等。對檢測器要求是高靈敏度；低噪聲；大的線性范圍；對所有化合物都響應(yīng)。與GC一樣。用得最多的是UV檢測器，常用于有雙鍵的芳香族化合物檢測，有UV吸收就可用UV檢測器。因為UV對甲醇，水無吸收，所以甲醇，水可用作流動相。檢測器噪聲一般由于電引起。(一) 檢測器分類1按性質(zhì)或應(yīng)用范圍分類有總體性能檢測器和溶質(zhì)性能檢測器?？傮w性能檢測器，是響應(yīng)值取決于流出物(含樣品與流動相)某些物理性質(zhì)的總的變化的檢測器。屬于這類檢測器的有示差折光、電導(dǎo)等檢測器,GC中的熱導(dǎo)檢測器也屬于這類檢測器。溶質(zhì)性能檢測器是響應(yīng)值取決于流動相中溶質(zhì)的物理或化學(xué)特性的檢測器。屬于這類檢測器較多，有紫外檢測器、熒光檢測器、化學(xué)發(fā)光檢測器、安培檢測器、手性檢測器等。因為溶質(zhì)性能檢測器僅對被測定物質(zhì)有較大響應(yīng)，而流動相沒有響應(yīng)或響應(yīng)很小，所以檢測靈敏度高，受操作條件變化和外界環(huán)境影響小，并且可用于梯度洗脫操作。但與總體性能檢測器相比，應(yīng)用范圍受到限制。總體性能檢測器和溶質(zhì)性能檢測器的劃分也不是絕對的，例如紫外-可見檢測器常用作溶質(zhì)性能檢測器，但在間接光度離子色譜法中則成為總體性能檢測器。2按測量信號性質(zhì)分類有濃度型檢測器和質(zhì)量型檢測器。濃度型檢測器的響應(yīng)值正比于溶質(zhì)在流動相中的濃度，測量的是流動相中溶質(zhì)濃度的瞬間變化，大部分液相色譜檢測器屬這一類檢測器。當(dāng)樣品量一定時，檢測器瞬間響應(yīng)，峰高響應(yīng)值與流動相流速無關(guān)；峰面積響應(yīng)值與流動相流速成反比，峰面積與流速乘積為常數(shù)。質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)值正比于單位時間內(nèi)通過檢測器的物質(zhì)的質(zhì)量，峰面積與流動相流速無關(guān)，峰高響應(yīng)值與流速成正比。例如庫侖檢測器就是質(zhì)量型檢測器。3按測量原理分類有熱學(xué)性質(zhì)檢測器、光學(xué)性質(zhì)檢測器、電學(xué)及電化學(xué)性質(zhì)檢測器等。光學(xué)性質(zhì)檢測器是根據(jù)被測物質(zhì)對光的吸收、發(fā)射和散射等性質(zhì)進(jìn)行檢測的。有較多的液相色譜檢測器屬這一類檢測器，例如紫外-可見檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、化學(xué)發(fā)光檢測器、手性檢測器等。電學(xué)及電化學(xué)性質(zhì)檢測器是根據(jù)被測物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測的，常用的有安培檢測器、電導(dǎo)檢測器、庫侖檢測器、介電常數(shù)檢測器、極譜檢測器等。該類檢測器通常駐將色譜流出液作為化學(xué)電池的一個組成部分，通過測量電池的某種參數(shù)(如電流、電阻、電量等)進(jìn)行檢出和測定。性質(zhì)進(jìn)行檢測的。利用熱學(xué)原理進(jìn)行檢測的熱學(xué)性質(zhì)檢測器有光聲、熱透鏡和光熱偏轉(zhuǎn)檢測器等，分別利用了光聲光譜和光熱光譜等技術(shù)。激光檢測器的應(yīng)用使靈敏度得到較大的提高，這類檢測器的應(yīng)用仍有待于發(fā)展。4其它分類按信號記錄方式不同可分為積分型和微分型檢測器；按樣品是否變化可分為破壞性和非破壞性檢測器。以上各種檢測器中最常用的液相色譜檢測器依次是紫外檢測器、示差折射檢測器、熒光檢測器和電化學(xué)檢測器等。近年來出現(xiàn)的光散射檢測器是新興的通用型檢測器。近年來發(fā)展迅速的光電二極管陣列檢測器雖然價格較高，仍不失為一種較理想的檢測器。(二) 常用檢測器的主要性能檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。評價檢測器主要考慮以下幾點:噪聲；基線漂移；靈敏度；線性范圍；檢測池的體積。檢測器的線性、靈敏度和柱外效應(yīng)三個基本特性直接影響色譜定量分析的準(zhǔn)確度、精密度和再現(xiàn)性。檢測器的線性范圍：大部分廠商都聲稱它們的檢測器在一定的濃度范圍內(nèi)是線性響應(yīng)。靈敏度在色譜分析中有三種不同的表示法，有檢測器本身的靈敏度、整個色譜體系的濃度靈敏度和質(zhì)量靈敏度。對于定量分析來說，最重要的是色譜體系的靈敏度，它還包括色譜柱以及儀器的其它部分的影響。檢測器的靈敏度(CD),實際上指檢測限，即通常指相當(dāng)于兩倍噪音信號的溶質(zhì)濃度。而色譜體系的最小檢測限應(yīng)是柱外效應(yīng)10%的最大進(jìn)樣體積所對應(yīng)的二倍于噪音峰高所對應(yīng)的樣品濃度。對于毛細(xì)管氣相色譜和高效液相色譜，檢測器的色譜峰展寬是柱外效應(yīng)的一個主要來源。一般儀器廠商在設(shè)計時已把檢測器的色譜峰展寬減少到最低程度。 八十年代初就有各種各樣的液相色譜檢測器問世，最流行的是可變波長檢測器，固定波長檢測器由于最適用于各種芳香化合物檢測,也得到廣泛應(yīng)用。折光指數(shù)檢測器，主要是應(yīng)用于空間排阻色譜在高分子工業(yè)以及食品和飲料工業(yè)中糖的檢測。發(fā)展最迅速的是可變波長光電檢測器和電化學(xué)檢測器。激光檢測器的使用，包括光掃描、熒光、光電離子化、熱光離子化、折光率、光度和聲光檢測器。在離子色譜(IC)中改進(jìn)選擇性和敏感度。液相色譜新的檢測技術(shù)不斷發(fā)展，以適應(yīng)毛細(xì)管和微球柱大小的需要，近幾年正在迅速發(fā)展的液相色譜檢測技術(shù)，有光譜和電化學(xué)檢測器二大領(lǐng)域，也考慮到擴大柱后流動試劑檢測領(lǐng)域。在液相色譜中生物化學(xué)柱后反應(yīng)檢測技術(shù)，酶、蛋白質(zhì)和抗體的使用，改進(jìn)檢測器選擇性和敏感度。當(dāng)今面臨控制環(huán)境污染分析和監(jiān)測方面的挑戰(zhàn)，提供分析金屬離子的色譜技術(shù)，液相色譜技術(shù)同特殊元素檢測相結(jié)合，可以分離金屬絡(luò)合物結(jié)構(gòu)，對于大氣、水、殘渣和魚類的金屬離子分析具有重要意義。在近年來興起的DNA分析領(lǐng)域中，已有不少人報道評價聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)品的液相色譜分離和檢測中定量分析準(zhǔn)確度和精密度。 各種各樣檢測器的研究論文層出不窮，如紫外可見光度檢測器， 拉曼光譜檢測器，熒光檢測器，化學(xué)熒光檢測器，質(zhì)譜檢測器，電化學(xué)檢測器，核磁共振檢測器以及光電二極管陣列檢測器等。近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)激光散射檢測器(FLSD)有希望成為高效液相色譜全新的通用靈敏的質(zhì)量型檢測器。總之，檢測器研究的共同方向均朝著靈敏度高、重現(xiàn)性好、響應(yīng)快、線性范圍寬、適應(yīng)范圍廣、對流動相流量和溫度波動不敏感、死體積小等特性。表8-3檢測器的主要性能性能/檢測器紫外熒光折光安培電導(dǎo)測量參數(shù)吸光度熒光強度折射率電流電導(dǎo)率類型選擇性選擇性通用選擇性選擇性池體積11032031011噪聲/測量參數(shù)單位10-410-310-710-910-3最小檢測濃度/g/mL10-1010-1110-710-12103線性范圍103103104105104溫度影響小小大大大流速影響無無有有有可否用于梯度洗脫能能不能不能不能對樣品有無破性無無無無無（三） 紫外檢測器（UVD）1. 工作原理與結(jié)構(gòu)紫外-可見光檢測器（UVD）又稱紫外檢測器。約有80的樣品可以使用這種檢測器，是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器。它可分為固定波長、可變波長和二極管陣列檢測器三種類型。固定波長紫外檢測器常采用汞燈的254nm或280nm譜線，許多有機官能團可吸收這些波長?？勺儾ㄩL紫外檢測器實際上是紫外可見分光光度計作檢測器。它既可測紫外區(qū)（190350nm)的光吸收變化，也可向可見光區(qū)(350700nm)延伸。紫外檢測器由光源、流通池和記錄器組成，其工作原理是進(jìn)入檢測器的組分對特定波長的紫外光能產(chǎn)生選擇性吸收，其吸收度與濃度的關(guān)系符合光吸收定律。光學(xué)系統(tǒng)如圖8-16，由光源產(chǎn)生波長連續(xù)可調(diào)的紫外光或可見光，經(jīng)過透鏡和遮光板變成兩束平行光，無樣品通過時，參比池和樣品池通過的光強度相等，光電管輸出相同，無信號產(chǎn)生；有樣品通過時，由于樣品對光的吸收，參比池和樣品池通過的光強度不相等，有信號產(chǎn)生。根據(jù)朗伯比爾定律，樣品濃度越大，產(chǎn)生的信號越大，紫外檢測器靈敏度高，檢測下限約為10-10gmL；而且線性范圍廣，對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫;不破壞樣品，可用于制備。紫外檢測器缺點是只對具有-或P-共軛結(jié)構(gòu)的化合物才能檢測。流動相的選擇有一定限制。圖8-16紫外檢測器的光學(xué)系統(tǒng)2. 特點UVD廣泛應(yīng)用源于以下的特點:（1）靈敏度高；噪聲低，可降至10-4。最小檢測濃度達(dá)10-10 g/mL。最小檢測量達(dá)10-12 g數(shù)量級。線性范圍寬，應(yīng)用廣泛。（2）對流動相基本無響應(yīng)，屬溶質(zhì)性能檢測器。受操作條件變化和外界影響很小，一般對流速和溫度不太敏感，適用于梯度洗脫。（3）屬選擇性檢測器，對無紫外吸收的物質(zhì)如飽和烴及有關(guān)衍生物無響應(yīng)。（4）需選用無紫外吸收持性的溶劑作流動相。（5）屬濃度敏感型檢測器。（6）屬非破壞性檢測器，可要用于制備色譜，也能與其它檢測器串聯(lián)使用。（7）結(jié)構(gòu)簡單，維修方便。3. 光電二極管陣列吸光度檢測器(photodiode array detector； PDAD)1982年惠普公司推出世界上首臺光電二極管陣列檢測器以來，HPLC獲得許多重大發(fā)展，一次進(jìn)樣可得到更多信息，數(shù)據(jù)處理更快。光電二極管陣列檢測器有1024個二極管陣列，是同時可以得到吸光度、波長、時間這樣三維光譜-色譜圖情報的檢測器。能以實際的時間瞬時測定在所有波長上的吸光度，可得到立體的光譜-色譜圖(見圖8-17)。為分析工作者提供了十分豐富的定性定量信息。二極管陣列檢測器的特殊功能在許多領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用。(1)在藥物學(xué)和毒物學(xué)中的應(yīng)用生物體內(nèi)的毒品藥物代謝產(chǎn)物的研究鑒定是個難題，尤其是濃度低及復(fù)雜生物基體組成變化時，識別更困難。藥物代謝光譜往往與原藥物相似。用二極管陣列檢測器，可以將每個色譜峰的光譜圖與原藥物光譜圖進(jìn)行比較來確認(rèn)原藥代謝物色譜峰。(2) 在生物科學(xué)中的應(yīng)用肽和蛋白質(zhì)的制備過程中，必須控制最終產(chǎn)品的純度。高效液相色譜法可分離出肽和蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)。由于肽和蛋白質(zhì)的光譜差異性很小，用普通紫外檢測器不能檢測出肽和蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)，只有利用極管陣列檢測器提供的高重現(xiàn)性光譜才能準(zhǔn)確測定。(3) 在環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用飲用水中農(nóng)藥污物的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是GC-MS聯(lián)用法。但對不穩(wěn)定化合物，HPLC是一種理想方法。利用二極管陣列檢測器結(jié)合自動譜圖檢索，成功分析了飲用水中的苯脲類除草劑、三嗪類農(nóng)藥及甲氨酸脂。有文獻(xiàn)報導(dǎo)在河水檢測中，利用固相萃取-液相色譜-二極管陣列檢測器建立自動報警系統(tǒng)：該系統(tǒng)利用聚合物固相萃取裝置和二極管陣列檢測器，在5060min內(nèi)可分析100mL河水中100150種有機微量污物。(文獻(xiàn)：Wilson I.D.andBrinkman U.A.Th,J.Chrmatogr.A,203,1000:325356)圖8-17 立體的光譜-色譜圖（四） 示差折光檢測器（differential refractive index detector）示差折光檢測器是除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器。1. 工作原理示差折光檢測器是通過連續(xù)測定色譜柱流出液折光率的變化來檢測樣品濃度的。就是檢測參比池（流動相本身）和樣品池中流動相之間的折光率差值。差值與濃度呈正比。見圖8-15和圖8-16，當(dāng)參比池與測量池充滿流動相時，它們的折光率相等，此時，光強相抵消，當(dāng)測量池有組分時，因折光率與流動相不同，則折光發(fā)生一個距離的偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)程度與組分的性質(zhì)、濃度有關(guān)。圖8-15示差折光檢測器原理圖8-16示差折光檢測器圖8-17偏轉(zhuǎn)式差示折光檢測器光路圖2特點示差折光檢測器的優(yōu)點是通用性強，操作簡便；缺點是靈敏度低，對溫度變化敏感。此外，由于洗脫液組成的變化會使折射率變化很大，因此，這種檢測器也不適用于梯度洗脫。（1）示差折光檢測器屬于總體性能檢測器，是根據(jù)不同物質(zhì)具有不同折射率來進(jìn)行組分檢測的。凡是具有與流動相折射率不同的組分，均可以使用這種檢測器。如果流動相選擇適當(dāng)，可以檢測所有的樣品組分，因此是一種通用型檢測器。它對沒有紫外吸收的物質(zhì)，如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等都能檢測。示差折光檢測器還適用于流動相紫外吸收本底大，不適合用紫外檢測器的體系。在凝膠色譜中示差折光檢測器是必不可少的，尤其是對聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡膠等的分子量分布的測定。（2）屬濃度敏感型檢測器。其響應(yīng)信號與溶質(zhì)濃度成正比。（3）示差折光檢測器屬于中等靈敏度檢測器，靈敏度不高是差折光檢測器的最大缺點。最小檢測濃度達(dá)10-6 10-7g/mL，不能做痕量分析。線性范圍寬小于105。（4）示差折光檢測器對壓力和溫度變化敏感。折光物質(zhì)由于壓力和溫度變化引起該物質(zhì)密度變化，而導(dǎo)至折射率的改變。（5）示差折光檢測器最常用的溶劑是水，原則上所有透明溶劑都可以使用。流動相強度與的折射率無關(guān)。選擇適合的溶劑，檢測器的響應(yīng)可以加強。示差折光檢測器最大的優(yōu)點是其通用性，但這同時也是它的缺點。由于溶劑之間的折射率只相差零點幾個折光單位，因此溶劑組成的任何變化對測定都有有明顯影響，如二元、三元溶劑混合不完全；色譜柱漏液；溶劑中有氣泡等。一般空氣飽和溶劑的折射率較穩(wěn)定，故常采用空氣飽和溶劑作流動相。另外，為避免流通池中氣泡的形成，還要將檢測器的流動相出口位置提高。（6）示差折光檢測器不能用于梯度洗脫。3結(jié)構(gòu)示差折光檢測器有反射型和折射型，見圖8-15。反射式示差折光檢測器是根據(jù)下述原理制成的：光在兩種不同物質(zhì)界面的反射百分率與入射角和兩種物質(zhì)的折射率成正比。如果入射角固定，光線反射百分率僅與這兩種物質(zhì)的折射率成正比。光通過僅有流動相的參比池時，由于流動相組成不變，故其折射率是固定的；光通過工作池時，由于存在待測組分而使折射率改變，從而引起光強度的變化，測量光強度的變化，即可測出該組分濃度的變化。偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器是根據(jù)下述原理：當(dāng)一束光透過折射率不同的兩種物質(zhì)時，此光束會發(fā)生一定程度的偏轉(zhuǎn)，其偏轉(zhuǎn)程度正比于兩物質(zhì)折射率之差。（五）熒光檢測器(fluorescence detector；FD)熒光檢測器適用于本身具有熒光的物質(zhì)，或?qū)o熒光物質(zhì)衍生成熒光體物質(zhì)的檢測。1工作原理物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級，這些電子從高能級躍至低能級時，物質(zhì)會發(fā)出比入射光波長較長的光，這種光稱為熒光。在其他條件一定的情況下，熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比。許多有機化合物具有天然熒光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反應(yīng)法或柱前反應(yīng)法加入熒光化試劑，使其轉(zhuǎn)化為具有熒光活性的衍生物。在紫外光激發(fā)下，熒光活性物質(zhì)產(chǎn)生熒光，由光電倍增管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴D8-18熒光檢測器光路示意圖2特點（1）檢測器靈敏度非常高，其檢出量可達(dá)10-13g，熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器高出23個數(shù)量級，適合于痕量分析。蒽是常用的衡量檢測器靈敏度的基準(zhǔn)物質(zhì)。（2）有良好的選擇性。熒光檢測器的高選擇性能夠避免不發(fā)熒光分子的干擾，這是其獨特的優(yōu)點。它適合于稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定。（3）線性范圍較寬，約104105。（4）受外界條件的影響較小。（5）只要選擇作流動相的溶劑不發(fā)熒光，熒光檢測器就能用于梯度洗脫。（6）其缺點是應(yīng)用范圍較窄。（六）其它檢測器檢測器主要有安培檢測器、電導(dǎo)檢測器、庫侖檢測器、極譜檢測器等。檢測器已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物和活體代謝物的分析、食品衛(wèi)生、臨床化學(xué)、和生物醫(yī)學(xué)研究等。1安培檢測器安培檢測器要求在電解池內(nèi)有電解反應(yīng)發(fā)生，即在外加電壓力作用下，利用被測物質(zhì)在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化進(jìn)行測定的一種方法。原則上凡是具有電活性的化合物都可用安培檢測器來檢測。有如下特點：（1）安培檢測器特點是靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬、結(jié)構(gòu)簡單、檢測池體積小、柱外效應(yīng)較小、噪聲低、響應(yīng)速度快。（2）檢測器所使用的流動相必須具有導(dǎo)電性。安培檢測器采用的流動相中必須有濃度為0.01 0.1 mol/L的電介質(zhì)存在。（3）安培檢測器對流動相的流速、溫度、PH值等比較敏。（4）測量還原電流時，流動相中痕量的氧也可能發(fā)生電解反應(yīng)，引起干擾。（5）由于電極表面可能發(fā)生吸附、催化等氧化還原反應(yīng)，電極都有一定壽命，目前還沒有可靠的再生方法，因此需要經(jīng)常清洗與理換。2電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器已成為離子色譜最常用的檢測器。與安培檢測器不同，電導(dǎo)檢測池內(nèi)沒有化學(xué)反應(yīng)發(fā)生，電導(dǎo)檢測器是通過測量溶液中離子的電導(dǎo)變化來測定樣品濃度的。電導(dǎo)檢測器結(jié)構(gòu)簡單、成本低、線性范圍寬、死體積小。原則上離子狀態(tài)的物質(zhì)都可以用電導(dǎo)檢測器檢測。電導(dǎo)檢測器是一種通用型的電化學(xué)檢測器。(七)蒸發(fā)光散射質(zhì)量檢測器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD)HPLC的發(fā)展中受到限制的一個原因, 就是缺少像GC中的FID一樣的靈敏、通用型的檢測器。20世紀(jì)80年代后研制的蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器給這一領(lǐng)域帶來希望，并向具有真正通用型意義的檢測器方向發(fā)展。這就是：樣品結(jié)構(gòu)不需要具備紫外發(fā)色團和合適的折射率；對梯度洗脫和流動相系統(tǒng)的溫度變化不敏感；對各種物質(zhì)的響應(yīng)因子很接近；在一次分析中可以同時檢測主要成分和雜質(zhì)。 1原理在一定的條件下，光散射強度正比于溶質(zhì)粒子的大小和數(shù)量。散射光強度與樣品微粒質(zhì)量的關(guān)系為I = k mb (8-28)(8-28)式中，m為微粒質(zhì)量，k、b為實驗條件（如溫度、流動相性質(zhì)）決定的常數(shù)。因此可根據(jù)散射光強度對樣品進(jìn)行定量分析。散射質(zhì)量檢測和電導(dǎo)測定一樣，電導(dǎo)是所有離子的通用性質(zhì)，光散射是所有粒子的通用性質(zhì)。對于色譜法來說，溶質(zhì)已經(jīng)分離，關(guān)鍵的問題是如何除去流動相和保證檢測條件的一致性。蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器的工作原理見圖8-19：經(jīng)色譜柱分離的組分隨流動相進(jìn)入霧化器，被高速的載氣流（氦氣、氮氣或空氣）噴成一種薄霧。這些霧粒子進(jìn)入可控制溫度的蒸發(fā)器（漂移管）中，使流動相氣化蒸發(fā)，溶劑蒸發(fā)后剩下的不揮發(fā)組分成為微小的霧狀顆粒，進(jìn)入光散射池進(jìn)行檢測。在光散射池中溶質(zhì)被光源照射而產(chǎn)生光散射，根據(jù)散射光強度正比于溶質(zhì)粒子數(shù)目及粒子的大小，確定組分的含量。2結(jié)構(gòu)（1）霧化池中霧化：經(jīng)色譜分離的組分隨流動相進(jìn)入與色譜柱出口直接相連的霧化器針管中，在霧化器末端器流出物與高速氣流（霧化載氣流速：2 5 L / min）混合成均勻的氣溶膠霧狀顆粒。（2）漂移管中蒸發(fā)：這些氣溶膠霧狀顆粒進(jìn)入可以控制溫度（蒸發(fā)器溫度：100 180）的蒸發(fā)漂移管中，使流動相汽化蒸發(fā)，只剩下?lián)]發(fā)性較小的被測物質(zhì)霧狀顆粒，它們高速通過蒸發(fā)漂移管進(jìn)入光散射池。（3）光電檢測器中檢測：在光散射池中，光源光線通過光散射池中的被測物質(zhì)霧狀顆粒，然后被光阱捕集，以防止反射。樣品顆粒散射光源發(fā)出的光用光電檢測器接收，轉(zhuǎn)換成電信號。蒸氣狀態(tài)溶劑通過光路時，光線反射到檢測器上成為穩(wěn)定的基線信號。霧狀溶質(zhì)顆粒通過光路時，被檢測器收集。測量得的信號與在光散射池中樣品的量成正比。圖8-19蒸發(fā)光散射質(zhì)量檢測器的工作原理3 蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器的優(yōu)缺點(l)通用性強，靈敏度高于示差折光檢測器。靈敏度低于熒光、紫外檢測器。(2)對流動相系統(tǒng)溫度變化不敏感?？蛇M(jìn)行梯度洗脫。(3)響應(yīng)因子具有一致性。蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器的響應(yīng)值僅取決于光束中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量，檢測器對的有物質(zhì)幾乎具有相同的響應(yīng)因子。因此無需測定定量校正因子。(4)可消除流動相和雜質(zhì)的干擾，提高了分辯率。與光吸收檢測器相比，能解決最困難的HPLC檢測問題。如磷脂、皂甙、糖類、聚合物、樹脂等無紫外吸收或紫外吸收系數(shù)很小的化合物的檢測。(5)便于應(yīng)用于質(zhì)譜分析。因為蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器與質(zhì)譜條件的要求是一致的。(6) 蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器受樣品組分和流動相揮發(fā)性因素限制。要求樣品組分應(yīng)是非揮發(fā)性或半揮發(fā)性的，而流動相應(yīng)是揮發(fā)性溶劑。(7) 對某些樣品，蒸發(fā)散射質(zhì)量檢測器線性范圍窄，有時不呈現(xiàn)線性關(guān)系，定量分析較為復(fù)雜。(八) 化學(xué)發(fā)光檢測器(CL)化學(xué)發(fā)光分析具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡單的優(yōu)點，但選擇性較差。而高效液相色譜是非常有效的分離手段，將兩者聯(lián)用，可克服化學(xué)發(fā)光分析選擇性差的缺點。而化學(xué)發(fā)光檢測器又為高效液相色譜提供了高靈敏度的檢測手段。1原理化學(xué)發(fā)光檢測器和熒光檢測器有相似之處，兩者都是發(fā)光檢測法，量激發(fā)態(tài)中間體的產(chǎn)生方式不同，化學(xué)發(fā)光檢測法由人學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，而熒光檢測法基于對光源光能的吸收?；瘜W(xué)發(fā)光檢測器不需要激發(fā)光源，而來自激發(fā)光源背景噪聲影響了熒光檢測法靈敏度。因此化學(xué)發(fā)光檢測法靈敏度要比熒光檢測法高二人數(shù)量級?？梢耘c激光誘導(dǎo)熒光檢測法相媲美。化學(xué)發(fā)光檢測法的檢測限可達(dá)10-15 10-18moL。2特點(1)與熒光檢測法相比，化學(xué)發(fā)光檢測通?？墒轨`敏度提高30-100%，在酶參加的反應(yīng)中該方法的選擇性也大為提高。(2)與激光誘導(dǎo)的熒光檢測法相比，化學(xué)發(fā)光檢測器對衍生試劑有較寬的選擇范圍，激光誘導(dǎo)的熒光檢測儀器價格昂貴。(3)化學(xué)發(fā)光強度對各種環(huán)境因素是敏感的。如溫度、溶劑、離子強度、pH和其它物質(zhì)的存在?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)射強度不是常數(shù)，而是隨時間而變化。發(fā)射強度隨時間衰變曲線不同的CL反應(yīng)，有不同的衰變曲線。即使同一反應(yīng)，在不同的條件其衰變曲線也不同。3應(yīng)用(1) 過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光反應(yīng)熒光化合物測定。多環(huán)芳烴，氨基多環(huán)芳烴，蒽、芘、苯并芘、氨基蒽、氨基芘。熒光衍生分析物的測定。一些分析物本身沒有熒光，因此必須進(jìn)行熒光衍生反應(yīng)，一般衍生在柱前完成。丹磺酰氯及其衍生物。丹磺酰氯是一種非常靈敏的熒光標(biāo)記試劑，它的分子體積小，已廣泛采用。主要用于伯、仲胺和酚羥基化合物。如氨基酸、兒茶酚胺、甾二醇以及某些化合物。丹磺酰氯可用來衍生羰基化合物，如醛、酮、酮基皮質(zhì)甾類、氧代甾族化合物和膽質(zhì)酸。其它衍生物試劑，如熒光胺已用于衍生兒茶酚胺。香豆素類試劑可用于衍生含羰基的羧酸和前列腺素、胺和氟代嘧啶類化合物。檢測由酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫。酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫在過量的熒光物質(zhì)存在下可由化學(xué)發(fā)光檢測器。此反應(yīng)可在pH=7完成，接近大多數(shù)的酶反應(yīng)的pH。檢測能熄滅過氧草酸酯化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)。過氧草酸酯的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可被某些物質(zhì)熄滅，使發(fā)光強度大大降低?；诖嗽?，已研究過HPLC-熄滅化學(xué)發(fā)光檢測器，可用于溴化物、碘化物、硫化物、亞硫酸鹽、苯胺類及某些有機硫化合物。(2) 魯米諾(Luminol)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)金屬離子可催化Luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，因此，金屬離子用離子交換柱分離后，可用Luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)測定。如：Cu2+、Co2+、Ni2+利用絡(luò)合劑與催化劑反應(yīng)，對Luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。氨基酸；藥物（兒茶酚胺、氨基糖苷抗菌素、慶大霉素）；蛋白質(zhì)（球蛋白、白蛋白）。用Luminol作為標(biāo)記試劑。測定luminol及衍生物的濃度已用于羧酸、胺、甲基睪酮、氨基酸、核苷、地谷新、人血清中脫氧麻黃堿等的測定。(3) 光澤精化學(xué)發(fā)光反應(yīng)利用血液及尿液中有機還原劑（還原性糖、抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、尿酸等）與光澤精的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。通過HPLC分離后，用光澤精體系檢測這些還原性物質(zhì)。(4) 生物發(fā)光反應(yīng)可測三磷酸腺苷、膽酸、肌醇磷酸酯異構(gòu)體(5) 其它化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 釕試劑化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。釕試劑和還原劑作用可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)脂肪胺與試劑反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的次序：叔胺仲胺伯胺，芳香胺幾乎不發(fā)生反應(yīng)。釕試劑作為柱后化學(xué)發(fā)光反應(yīng)衍生試劑，用于脂肪叔胺的HPLC化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測，該檢測系統(tǒng)也曾用于抗生素氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的檢測。結(jié)論： 以過氧草酸酯CL和Luminol CL體系使用較多。 化學(xué)發(fā)光檢測法是最靈敏的方法之一，其靈敏度比普通熒光法一般高兩個數(shù)量級。 但CL和HPLC相偶合的條件需要進(jìn)一步研究和優(yōu)化。 為了拓寬分析物的范圍，衍生化技術(shù)的深入研究仍是很重要。五、色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜數(shù)據(jù)處理通過ADC轉(zhuǎn)換器,把模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,然后采用色譜軟件處理給出色譜圖等信息。（一） 峰的檢測峰的檢測和判別是依據(jù)在基線的訊號水平上，預(yù)設(shè)一個“閾值”，超過該值時，判別為峰可開始檢測。有各種判別峰的起點與終點的方法,各有利用弊,一般常采用下面兩種方式判別峰訊號的變化。1斜率判別法(一階導(dǎo)數(shù)法)。依照信號斜率的變化檢測信號，如圖8-20的右圖，用此方法，斜率設(shè)定必須合適,不可過大或過小。斜率參數(shù)設(shè)定過大，支丟失部分峰面積，甚至于峰丟失。斜率參數(shù)設(shè)定過小，會引入雜質(zhì)峰面積。斜率參數(shù)設(shè)定通?？梢酝ㄟ^空白基線白的檢測自動設(shè)定。2依照積分面積檢測峰信號:色譜峰面積(或峰高)正比于該組分的濃度。峰面積的準(zhǔn)確測量取決于基線的判斷。圖8-20保留時間和峰面積的計算(二) 數(shù)據(jù)采集(三) 基線修正基線修正依賴于另一個參數(shù):漂移。若事先未設(shè)定漂移值，即默認(rèn)為“0”，會對基線作自動修正。(四) 重疊峰的分離：在色譜分析中，經(jīng)常會遇到基線漂移和色譜峰不能完全分離的情況。通常采用谷-谷規(guī)則或預(yù)設(shè)基線漂移值參數(shù)來解決。也可自動處理或人工修正。1自動程序如果要改變條件重復(fù)分析，通常要更換各種參數(shù)(如峰寬、斜率、漂移、最小峰面積、變參時間、鎖定時間、衰減、樣品量、內(nèi)標(biāo)一、校正次數(shù))。可把不同條件設(shè)定在不同文件中，每次分析時變更文件號就可以。2人工修正(五) 色譜儀自動定性和定量分析定量計算是把各種計算公式編制成應(yīng)用軟件存入計算機，通過鍵盤來選擇所需方法。微處理機在定量計算時,一般通過保留值來識別峰。但由于各種因素的影響,在重復(fù)多次分析中,保留值會有一定的變化,可采用下述兩種方法確定保留值的變化范圍。1. 定性分析峰定性可采用絕對保留時間或相對保留時間法，前一種鑒別位于預(yù)定保留時間容限內(nèi)的峰，后者根據(jù)分析條件變化引起保留時間相對變化，用相對保留時間法鑒別色譜峰。絕對保留時間法中，只要被測組分的標(biāo)準(zhǔn)保留時間與實測時間的差值小于保留時間容限就可被鑒別。保留時間容限可用時間窗或時間帶來表示。前者是為每一個峰都設(shè)定一個時間作容限；后者是對所有峰都用相同百分?jǐn)?shù)作容限。(1)“時間窗”法 (Time Window)：tRt對整個色譜圖上各個峰的保留值都設(shè)定相同區(qū)間“時間窗” ，規(guī)定圖中各個峰保留時間的變化范圍。該法設(shè)置簡單，但用于識別保留時間相差很近的相鄰峰不大方便。（2）“時間帶”法 (Time Band): tR(1a%)對每個需識別的定量峰，都設(shè)定一個保留時間的相對變動范圍。該設(shè)置較麻煩，但對不同峰可給出不同的變動范圍，對識別相鄰峰的分辨率較好，同時用于編組定量分析也很方便。1 定量分析及ID表所有色譜數(shù)據(jù)處理機均支持面積歸一、校正面積歸一、帶比例因子的校正面積歸一、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法等定量計算方法。建立合適的ID表（選擇合適的MODE）對準(zhǔn)確定量很重要。選擇內(nèi)容是：用峰面積還是用峰高定量方法；峰的識別用“時間窗”法還是“時間帶”法；校正方法用“單點”法還是“雙點”法。ID表內(nèi)容還包括：峰的保留時間；組分名等。圖8-21色譜工作站控制儀器參數(shù)示意圖(六) 色譜數(shù)據(jù)處理機和色譜工作站的差別色譜數(shù)據(jù)處理機的功能：色譜數(shù)據(jù)處理；A/D模數(shù)轉(zhuǎn)換接口，A/D模數(shù)轉(zhuǎn)換是將檢測器輸出的電壓信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，然后通過軟件對數(shù)字信號進(jìn)行處理。色譜工作站的功能見圖8-21：色譜工作站除了色譜數(shù)據(jù)處理機功能外，還有色譜儀控制卡，可控制儀器參數(shù)。目前國外的儀器廠家均有各自專用的色譜工作站。如島津批、安捷倫、PE等。色譜工作站配備的儀器控制功能可對色譜儀的一般操作條件進(jìn)行控制，包括程序升溫（梯度淋洗）、自動進(jìn)樣、流路切換、閥件控制等操作。(七) 色譜智能化和專家系統(tǒng)簡介色譜智能化是新一代色譜儀的發(fā)展方向,其特點是代替人的部分智能,選擇分析方法和確定最佳色譜條件,并有條件地進(jìn)行部分組分定性工作。這項工作不僅要求計算機技術(shù),更重要的是,要加強色譜的基礎(chǔ)理論研究,提高色譜操作技術(shù),特別是制備出性能穩(wěn)定的色譜柱,這樣才能使操作規(guī)范化,以實現(xiàn)人工智能色譜。色譜專家系統(tǒng)是色譜智能化的一個重要組成部分,它從人工智能和數(shù)值計算方法出發(fā)開展研究,應(yīng)包括以下幾大部分：1分離模式和柱系統(tǒng)的選擇；2預(yù)處理方法和檢測器的選擇；3分離條件最優(yōu)化；4在線色譜峰的定性和定量；5色譜硬件的診斷。圖8-23選擇流動相的一般方法圖8-23表達(dá)了選擇流動相的一般方法。將整個三角形代表所有的溶劑，首先排除一些物理性質(zhì)（沸點、粘度、紫外吸收）不適用于LC的溶劑（三角形底部用橫線劃的部分面積），在剩下物理性質(zhì)適用的溶劑中，不需選擇洗脫強度適當(dāng)?shù)娜軇催x擇能使被分析樣品中組分的容量因子k在110范圍內(nèi)的溶劑。對含多種組分的樣品，k在可擴展在0.520范圍內(nèi)。這樣又排除了圖8-23中打交叉線部分的面積。最后選擇分離因子大于1.05，這樣只有位于頂點的空白面積才能滿足要求。當(dāng)選擇了合適分離因子和容量因子k的溶劑后，還必須與柱效n高的色譜柱結(jié)合才能獲得滿意的分離度。由上述可知，表征溶劑特性的化學(xué)與物理參數(shù)對選擇溶劑很重要。（三）表征溶劑特征的重要參數(shù)表征溶劑特征的參數(shù)有沸點、分子量、相對密度、介電常數(shù)、偶極矩、折射率、紫外吸收截止波長等。與HPLC分離密切相關(guān)的是溶劑強度參數(shù)，溶解度參數(shù)，極性參數(shù)和黏度。這些參數(shù)值可在有關(guān)手冊中查到。1溶劑強度參數(shù)溶劑強度參數(shù)定義為溶劑分子在單位吸附劑表面積A上的吸附自由能E，表征了溶劑分子對吸附劑的親和程度。=E/A值越大，表示溶劑分子對吸附劑的親和能力越強。2溶解度參數(shù)溶解度參數(shù)表示溶劑的極性，這是從發(fā)子間作有力角度來考慮的。在正相液液色譜中，溶解度參數(shù)越大，洗脫強度也越大，會使容量因子k越小。在反相液液色譜中，溶解度參數(shù)越大，洗脫強度也越小，會使容量因子k越大。3極性參數(shù)P極性參數(shù)P又稱為極性指數(shù)，P是用Rohrshneider溶解度數(shù)據(jù)推導(dǎo)出來的。它表示每種溶劑與乙醇（參數(shù)xe）、對二氧六環(huán)（參數(shù)xd）、硝基甲烷（參數(shù)xn）三種極性物質(zhì)相互作用的量度。Xe反映了溶劑作為質(zhì)子接受體的量度，xd反映了溶劑作為質(zhì)子給予體的量度，xn反映了溶劑作為強偶極子之間相互作用的能力。極性參數(shù)P是判定溶劑洗脫強度的依據(jù)。常用溶劑的P和Xe、xd、xn可查表。在正相液液色譜中，極性參數(shù)P越大，洗脫強度也越大，會使容量因子k越小。在反相液液色譜中，極性參數(shù)P越大，洗脫強度也越小，會使容量因子k越大。因此可通過改變洗脫劑的P值，就可改變被分離樣品組分的選擇性。4黏度溶劑的黏度（動力黏度）是影響色譜分離的重要參數(shù)。溶劑的黏度大時，會降低溶質(zhì)在流動相中的擴系數(shù)及兩相間的傳質(zhì)速度，并降低了柱子的滲透性，導(dǎo)致柱效的下降和分析時間的延長。溶劑的黏度應(yīng)保持在0.40.5MPa.s以下。對黏度為0.20.3MPa.s的溶劑，可與黏度大的溶劑混合，組成溶劑強度范圍寬、黏度適用的混合溶劑。對黏度小于0.2 MPa.s的溶劑，由于沸點太低。在高壓泵輸送時會產(chǎn)生氣泡而不宜單獨使用。第五節(jié)