香菇多糖的提取方案(畢業(yè)論文05142).doc

重慶三峽學院畢業(yè)設計（論文）題 目 香菇多糖提取工藝的研究 院 系 生命科學與工程學院 專 業(yè) 生物技術 年 級 2008級 學生姓名 鮮曉洪 學生學號 200813064121 指導教師 王兆丹 職稱 講師 完成畢業(yè)設計（論文）時間 2011 年 5 月目錄一 文獻綜述21香菇多糖及香菇簡介22 國內研究現(xiàn)狀22.1 原料預處理技術32.2 粉碎技術32.3 超聲波技術33存在的問題和發(fā)展趨勢44 論文的選題與研究內容4二 實驗部分51材料與方法51.1 材料51.2 儀器與設備51.3 實驗方法51.3.1 苯酚- 硫酸法測定多糖標準曲線的制作51.3.2香菇多糖提取方法的確定51.4 實驗步驟61.5 單因子實驗71.5.1不同料液比對香菇多糖提取率的影響71.5.2 不同超聲時間對香菇多糖提取率的影響81.5.3 不同浸提溫度對香菇多糖提取率的影響81.5.4不同浸提時間對香菇多糖提取率的影響91.5.6最后確定每個因素的最佳水 平條件的因素水平見表1。92 結果與分析103討論124 結論12致謝13參考文獻14英文譯文15鮮曉洪 香菇多糖提取工藝的研究香菇多糖提取工藝的研究鮮曉洪（重慶三峽學院生命科學與工程學院生物技術專業(yè)2008級 重慶萬州 40400）摘要 以香菇作為原料，研究香菇中多糖提取得率及其影響因素。 優(yōu)化影響超聲波輔助水浸提法提取香菇多糖的因素, 提高多糖的提取率。設計單因子試驗和多因子的正交試驗, 研究料液比、超聲波處理時間、浸提溫度、浸提時間4個因子對香菇多糖提取率的影響。超聲波輔助水浸提法提取香菇多糖的最佳條件為: 料液比1：25、超聲波處理10 min、100 浸提2. 0 h。在該條件下, 香菇多糖提取率為4. 05%。通過優(yōu)化提取條件提高了香菇多糖的提取率, 為香菇多糖的開發(fā)利用奠定了基礎。關鍵詞 超聲波；香菇多糖；提取一 文獻綜述1香菇多糖及香菇簡介香菇-植物皇后。香菇，又稱香蕈、冬菇，是一種生長在木材上的真菌類。由于它味道鮮美，香氣沁人，營養(yǎng)豐富，不但位列草菇、平菇、白蘑菇之上，而且素有“植物皇后”之譽。香菇也是世界第二大食用菌，也是我國特產之一，在民間素有“山珍”之稱。它是一種生長在木材上的真菌。味道鮮美，香氣沁人，營養(yǎng)豐富，素有“植物皇后”美譽。香菇富含維生素B群、鐵、鉀、維生素D原（經日曬后轉成維生素D）、味甘，性平【1】。主治食欲減退，少氣乏力。香菇素有山珍之王之稱，是高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)保健食品。我國歷代醫(yī)學家對香菇均有著名論述?，F(xiàn)代醫(yī)學和營養(yǎng)學不斷深入研究，香菇的藥用價值也不斷被發(fā)掘。香菇中麥角甾醇含量很高，對防治佝僂病有效；香菇多糖（1，3葡聚糖）能增強細胞免疫能力，從而抑制癌細胞的生長；香菇含有六大酶類的40多種酶，可以糾正人體酶缺乏癥；香菇中的脂肪所含脂肪酸，對人體降低血脂有益。香菇多糖是從香菇中分離純化的一種葡聚糖，從香菇(Lentinus edodes)子實體或菌絲中分離的一種多糖，以-1,3葡聚糖為主，有免疫激活和抗腫瘤活性；是以增強T細胞和巨噬細胞功能為主的免疫增強劑，與化療或放療聯(lián)用可發(fā)揮增效減毒作用。2 國內研究現(xiàn)狀糖類的研究已有百余年的歷史，近20多年來，隨著膜的化學功能，免疫物質的化學研究的進展以及探尋新藥物資源的不斷拓展和研究的深入，發(fā)現(xiàn)糖類在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結構材料，更重要的是還參與了生命現(xiàn)象中細胞的各種活動，具有多種多樣的生物學功能。多糖一般由十個分子以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子多聚物。多糖按來源大致可分為植物多糖、動物多糖、海藻多糖、微生物多糖即細菌多糖和真菌多糖等。其中，具有很強生物活性的真菌多糖的研究日益受到重視，真菌多糖從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離，是一類可以控制細胞分裂分化、調節(jié)細胞生長和衰老的活性多糖。真菌多糖作為藥物研究始于20世紀50年代，在60年代以后成為免疫促進劑受到廣泛關注，其中香菇多糖(1entinan，LNT)是研究得較透徹的多糖之一。香菇多糖是從香菇( L entinus edod es )中提取的一種生物活性物質。研究表明, 它具有抑制腫瘤生長、提高機體免疫力、抗病毒和抗氧化等生物學活性 1- 6 。目前, 多糖的提取方法主要有水提醇沉法、堿液提取法、酶解法等 7- 11。傳統(tǒng)熱水提醇沉法能耗高、提取時間長; 堿液提取法反應劇烈、提取液又需進行中和, 這可能破壞多糖的結構、降低香菇多糖的分子量, 致使其藥用價值下降12; 酶解法雖然反應時間短、能大幅度提高多糖提取量, 但是酶的價格較高。超聲波在食品加工中的應用越來越廣泛, 在液體中它可以產生空化作用, 由空化作用產生的沖擊波和射流又可破壞細胞和細胞膜結構, 從而增加細胞內容物通過細胞膜的穿透力和傳輸能 13 。筆者采用單因子試驗和多因子的正交試驗探討了不同料液比、超聲時間、浸提溫度和浸提時間對提取香菇多糖的影響, 為香菇多糖的開發(fā)利用奠定了基礎。 香菇Lentinus edodes(Berk)Sing為擔子菌綱傘形科真菌，是世界名貴食用菌兼藥用菌之一。1968年日本千原吳郎首先利用熱水從香菇子實體中浸提出6種胞外多糖，1970年Chihard和Sasaki用熱水浸提結合有機溶劑沉淀從香菇中提取到另外4種多糖，20世紀80年代以來，LNT的研究受到廣泛的重視，取得了一系列進展。國內在這方面也取得了重要的進步。2.1 原料預處理技術在超市購買的成袋的干香菇，產于四川通江縣。足夠的分量。2.2 粉碎技術把購買的干香菇用粉碎機粉碎，在實驗室用小型的粉碎機對起進行粉碎，干香菇先手工弄成較小的碎塊，便于從粉碎機入口進去。粉碎后收集好粉末，便于提取時候用。2.3 超聲波技術超聲波提取中藥和天然藥物的簡易方法和機理說明：在容器中加入提取溶媒（水、乙醇或其他有機溶劑等），將中藥材根據需要粉碎或切成顆粒狀，放入提取溶媒中；容器的外壁粘接換能器振子或將振子密封于不銹鋼盒中投入容器中；開啟超聲波發(fā)生器，振子向提取溶媒中發(fā)出超聲波，超聲波在提取溶媒中產生的空化效應和機械作用一方面可有效地破碎藥材的細胞壁，使有效成分呈游離狀態(tài)并溶入提取溶媒中，另一方面可加速提取溶媒的分子運動，使得提取溶媒和藥材中的有效成分快速接觸，相互溶合、混合。 超聲波提?。ㄒ卜Q為萃?。┮云涮崛囟鹊?、提取率高、提取時間短的獨特優(yōu)勢被具有創(chuàng)新意識者應用于中藥材和各種動、植物有效含量的提取，是替代傳統(tǒng)剪切工藝方法實現(xiàn)高效、節(jié)能、環(huán)保式提取的現(xiàn)代高新技術手段。超聲波提取的原理：超聲波提取中藥材的優(yōu)越性，是基于超聲波的特殊物理性質。主要是主要通過壓電換能器產生的快速機械振動波來減少目標萃取物與樣品基體之間的作用力從而實現(xiàn)固-液萃取分離。 （1）加速介質質點運動。高于20 KHz聲波頻率的超聲波的連續(xù)介質（例如水）中傳播時，根據惠更斯波動原理，在其傳播的波陣面上將引起介質質點（包括藥材重要效成分的質點）的運動，使介質質點運動獲行巨大的加速度和動能。質點的加速度經計算一般可達重力加速度的二千倍以上。由于介質質點將超聲波能量作用于藥材中藥效成分質點上而使之獲得巨大的加速度和動能，迅速逸出藥材基體而游離于水中。 （2）空化作用。超聲波在液體介質中傳播產生特殊的“空化效應”，“空化效應”不斷產生無數(shù)內部壓力達到上千個大氣壓的微氣穴并不斷“爆破”產生微觀上的強大沖擊波作用在中藥材上，使其中藥材成分物質被“轟擊”逸出，并使得藥材基體被不斷剝蝕，其中不屬于植物結構的藥效成分不斷被分離出來。加速植物有效成份的浸出提取。 （3）超聲波的振動勻化（Sonication）使樣品介質內各點受到的作用一致，使整個樣品萃取更均勻。 綜上所述，中藥材中的藥效物質在超聲波場作用下不但作為介質質點獲得自身的巨大加速度和動能，而且通過“空化效應”獲得強大的外力沖擊，所以能高效率并充分分離出來。超聲波提取優(yōu)點1.提取效率高：超聲波獨具的物理特性能促使植物細胞組織破壁或變形，使中藥有效成分提取更充分，提取率比傳統(tǒng)工藝顯著提高達50500%； 2.提取時間短：超聲波強化中藥提取通常在2440分鐘即可獲得最佳提取率，提取時間較傳統(tǒng)方法大大縮短2/3以上， 藥材原材料處理量大； 3.提取溫度低：超聲提取中藥材的最佳溫度在4060，對遇熱不穩(wěn)定、易水解或氧化的藥材中有效成分具有保護作用，同時大大節(jié)能能耗； 4.適應性廣：超聲提取中藥材不受成分極性、分子量大小的限制，適用于絕大多數(shù)種類中藥材和各類成分的提??； 5.提取藥液雜質少，有效成分易于分離、純化； 6.提取工藝運行成本低，綜合經濟效益顯著； 7.操作簡單易行，設備維護、保養(yǎng)方便。 提取率提高50%500%；提取時間（分鐘）縮短2/3以上；提取溫度為4060，保護有效成份。3存在的問題和發(fā)展趨勢現(xiàn)在用超聲波輔助水提取存在提取不完全，殘留多。逐漸朝高效率發(fā)展，各國還在繼續(xù)研究最有效的提取方法，比如酶提取法。目前提取多糖的方法很多, 每種都有其優(yōu)缺點。要根據提取物性質、提取成本、工藝設備等選擇高效率、低能耗的提取工藝, 并對提取工藝優(yōu)化以適應規(guī)?；墓I(yè)生產需求, 這也是近年來食用菌多糖的研究熱點之一; 也對促進我國食用菌產業(yè)進一步向產業(yè)化、現(xiàn)代化方向發(fā)展, 和提高工業(yè)經濟效益等方面有著重大的意義。相信隨著現(xiàn)代分離技術和生化技術的發(fā)展, 食用菌多糖的提取會進入新的時代, 在抗腫瘤和提高人體免疫功能等醫(yī)藥方面發(fā)揮更大的作用。4 論文的選題與研究內容隨著香菇多糖在醫(yī)學上的應用，我們對其的需求量也是越來越大，所以我們需要研究香菇多糖最大的提取率。爭取實現(xiàn)以簡單的方法提取最多的香菇多糖。研究的內容：優(yōu)化影響超聲波輔助水浸提法提取香菇多糖的因素, 提高多糖的提取率。二 實驗部分1材料與方法1.1 材料香菇購置與學校旁邊超市，產于四川通江縣。1.2 儀器與設備粉碎儀器：小型粉碎機分光光度計：紫外線分光光度計錐形瓶：常用錐形瓶電磁爐：實驗室常用水浴鍋：實驗室常用水浴鍋超聲波：實驗清洗用超聲波1.3 實驗方法1.3.1 苯酚- 硫酸法測定多糖標準曲線的制作以葡萄糖為標準品, 精確配制濃度為100 ug/mL 的標準溶液, 依次量取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分別放入9支試管中, 蒸餾水補至1.0mL 然后加入0. 5mL苯酚( 5% )、2.5mL濃硫酸, 混勻器上混勻, 沸水浴10min, 室溫放置20 min后于490 nm 處測吸光度值。以葡萄糖含量為橫坐標, 以OD為縱坐標繪制標準曲線, 得到回歸方程: y= 0.0134x+ 0.0037, R2=0. 9996。1.3.2香菇多糖提取方法的確定分別向3個小燒杯中加入1.0 g香菇粉, 再加入20ml蒸餾水, 然后分別用水浸提法、微波法、微波輔助水浸提法、超聲波法和超聲波輔助水浸提法提取香菇多糖。其中, 水浸提法是將小燒杯在100水中浴浸提2.0 h; 微波法是將材料用微波(640W) 處理3min; 微波輔助水浸提法是將材料先微波(640W) 處理3 min后再100 水浴浸提2.0 h; 超聲波法是將小燒杯超聲波( 150W)處理15 min; 超聲波輔助水浸提法是將小燒杯超聲波( 150W )處理15min后100 水浴浸提2.0 h。各提取2次, 然后分別將濾液合并, 濃縮至2ml 再加入6ml無水乙醇, 4靜置過夜, 4000 r/min離心20min, 棄上清液, 加蒸餾水溶解并定容。按照葡萄糖標準曲線制作方法測OD490值,并計算多糖提取率。1.4 實驗步驟 香菇粉碎稱重浸提濾渣同法提取過濾合并上清液醇析蒸發(fā)濃縮4放置過夜離心干燥粗多糖Fig.1 The flow chart of extracting agaric polysaccharide圖1香菇多糖提取工藝流程圖1.5 單因子實驗探討不同因素對提取率影響的情況,只有一個因素作為變量，當該因素變化時，提取率隨著變化的情況。1.5.1不同料液比對香菇多糖提取率的影響香菇粉和蒸餾水按料液比分別為1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55 進行配制, 超聲處理15min后100 熱水浸提2. 0h, 浸提2次。由圖2可見, 隨料液比的增大, 香菇多糖的提取率也增大, 但是當料液比大于1 :20 ( 多糖提取率為3.90% )時, 提取率增加的幅度很小?？紤]到料液比過大會增加濃縮的時間, 所以初步將料液比定為1:20。圖2 料液比對香菇多糖提取率的影響1.5.2 不同超聲時間對香菇多糖提取率的影響香菇粉和蒸餾水按料液比為1：20進行配制, 超聲波處理15 min, 然后分別于70、80、90、100 浸提2. 0 h, 浸提2次。由圖3可知, 隨著浸提溫度的增加, 香菇多糖的提取率也在增加, 當浸提溫度為100 時多糖提取率最高( 3. 94% )。圖3超聲時間對香菇多糖提取率的影響1.5.3 不同浸提溫度對香菇多糖提取率的影響香菇粉和蒸餾水按料液比為1:20進行配制, 超聲波處理15 min, 然后分別于70、80、90、100 浸提2. 0 h, 浸提2次。由圖4可知, 隨著浸提溫度的增加, 香菇多糖的提取率也在增加, 當浸提溫度為100 時多糖提取率最高( 3.94% )。圖3圖4 浸提溫度對香菇多糖提取率的影響1.5.4不同浸提時間對香菇多糖提取率的影響香菇粉和蒸餾水按料液比為1：20進行配制, 超聲波處理15 min, 然后100 熱水浴分別浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h, 浸提2 次。由圖5可知, 隨浸提時間的延長, 香菇多糖提取率先升后降,當浸提時間為2. 0 h時多糖提取率最高( 3. 95% )。圖5 浸提時間對香菇多糖提取率的影響1.5.6最后確定每個因素的最佳水 平條件的因素水平見表1。表1 正交試驗因素水平Table 1 Levels and factors of L ( 34 ) orthogonal test水平LevelA料液比Material liquidratio B超聲時間minDisposing timeOf ultrasonicC浸提溫度minExtracting temperatureD浸提時間hExtracting time11:1510801.521:2015902.031:25201002.52 結果與分析按1.5.6進行操作，利用吸光度-葡萄糖濃度的標準曲線計算多糖得率，其正交試驗結果見表2。表2 香菇多糖提取的正交實驗結果試驗號A料液比 B超聲時間C浸提溫度D浸提時間香菇多糖提取率111112.85212222.95313333.02421233.15522312.87623123.03731323.98832133.33933213.01K18.829.989.218.73K29.059.159.119.96K310.329.069.879.5R1.50.920.761.59料液比的大小、浸提時間的長短和浸提溫度的高低都影響多糖的提取率, 超聲波處理時間過長又會導致多糖降解、活性降低, 因此選擇以上4個因素設計L9 ( 34)正交試驗, 結果見表2。由極差分析可知RDRARBRC 從而可以得出影響香菇多糖提取量因素的順序為: D A B C,即浸提時間 料液比 超聲處理時間浸提溫度, 最優(yōu)水平為A3B1D2C3,即超聲波輔助水浸提法提取香菇多糖的最佳提取條件為: 料液比1：25、超聲波處理10min、100浸提2.0 h。在該最優(yōu)條件下, 香菇多糖的提取率為4.05% 。為了驗證A3B1D2C3是最佳配方，與多糖最高得率A3B1C3D2比較（見圖6）， 由圖6可知A3B3C2D2為木耳多糖提取的最佳組合。圖6 最佳組合驗證3討論通過單因子試驗和多因子的正交試驗, 確定了各因素影響超聲波輔助水浸提法提取香菇多糖的大小排列順序為: 浸提時間 料液比 超聲處理時間浸提溫度, 香菇多糖提取的最佳條件為: 料液比1：25、超聲波處理10min、100 浸提2.0 h,在該條件下, 多糖的提取率為4.05%。4 結論該試驗建立了香菇多糖熱水浸提的最佳工藝，通過正交設計對提取溫度、提取時間、液料比、超聲波時間進行優(yōu)化，結果表明浸提時間對多糖得率具有顯著的影響，其次為料液比、超聲時間和浸提溫度。最優(yōu)組合為料液比1：25、超聲波處理10min、100 浸提2.0 h，此時香菇多糖得率為4.05%。致謝本次論文設計過程中，王兆丹老師對該論文從選題，構思到最后定稿的各個環(huán)節(jié)給予細心指引與教導,使我得以最終完成畢業(yè)論文設計。在學習中，王老師嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、豐富淵博的知識、敏銳的學術思維、精益求精的工作態(tài)度以及侮人不倦的師者風范是我終生學習的楷模，導師們的高深精湛的造詣與嚴謹求實的治學精神，將永遠激勵著我。這四年中還得到眾多老師的關心支持和幫助。在此，謹向老師們致以衷心的感謝和崇高的敬意！ 最后，我要向百忙之中抽時間對本文進行審閱，評議和參與本人論文答辯的各位老師表示感謝。參考文獻1 王謙.大型食用真菌的多糖類物質J.廣西輕工業(yè),1995(4):16-19.2 王玢,任清,李奇,等.香菇多糖的提取及其抗氧化性和保濕性評價J.食用菌,2008(5): 58-60.3 李小定,榮建華,吳謀成.真菌多糖生物活性研究進展J.食用菌學報,2002,9(4):50- 58.4 唐省三,朱曉琴.復合真菌多糖的抗腫瘤及免疫增強作用初探J.基礎醫(yī)學與臨床,2004, 24(5):599-600.5 QUZY,NIUMJ,GUOC L.Mechanism of antitumor action of LentinanJ.China Domestic Fungus,1997,16(5):3-4.6 MACQ,XIAR,PENGY, etal Studies of extract ion method of Lentinan and aminoacidsJ. 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