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附件浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院微生物育種學(xué)課程論文題目普那霉素生物合成機理及基因工程研究進(jìn)展姓名金慶超學(xué)號*分院生物與化學(xué)工程分院專業(yè)班級*任課教師金慶超 完成日期2008年6月9日摘要普那霉素(Pristinamycin)由始旋鏈霉菌 (Streptomyces pristinaespiralis)產(chǎn)生，包含普那霉素I (PI) 和普那霉素II (PII) 兩類化合物，主要用于治療由包括耐藥菌在內(nèi)的革蘭氏陽性菌引起的感染。目前，缺乏穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)菌株是制約普那霉素發(fā)酵生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的主要原因之一，其中利用基因工程的方法篩選高產(chǎn)菌株成為重要的研究熱點，本文就此方面進(jìn)行了簡要介紹。關(guān)鍵詞：始旋鏈霉菌；普那霉素；高產(chǎn)；分子機理；分子育種1. 前言普那霉素（pristinamycins）屬鏈陽性菌素類（streptogramin）抗生素, 由始旋鏈霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）產(chǎn)生，具有抑制生物蛋白合成的殺菌活性(1)。該類抗生素主要由普那霉素I (PI)和普那霉素II (PII)等兩類化合物組成，其含量分別為30和70。普那霉素I為環(huán)六肽內(nèi)酯（branched cyclic hexadepsipeptides），由普那霉素IA(含量約90-95%)、普那霉素IB(約5%)和普那霉素IC(約1%)組成；普那霉素II為多不飽和環(huán)內(nèi)酯(polyunsaturated macrolactones) ，由普那霉素IIA(約80%)和普那霉素IIB(約20%)組成。普那霉素IA和普那霉素IIA是普那霉素的主要組分(1;2)。2. 普那霉素的生物合成基因2.1 普那霉素I的生物合成基因普那霉素IA的分子骨架是由1個3-羥基吡啶羧酸(3-hydroxypicolinic acid chromophore)殘基和L-蘇氨酸(L-threonine)、D-氨基丁酸(L-aminobutyric acid)、L-脯氨酸(L-proline)、4-二甲基氨基-L-苯丙氨酸(4-dimethylamino-L-phenylalanine，L-DMPAPA)、4-酮-L-六氫吡啶羧酸(4-ketone-pipecolic acid)和L-苯甘氨酸(L-phenylglycine)等6個氨基酸殘基聚合而成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。PIA大環(huán)的第5位的L-DMPAPA殘基被4-甲基氨基-L-苯丙氨酸(4-methylamino-L-phenylalanine，L-MMPAPA)殘基替換就形成PIB, 而PIB的第3位D-氨基丁酸殘基被D-丙胺酸（D-alanine）殘基替換后又形成PIC分子。一般而言，PI的生物合成大體上可以分成三個過程：前體的形成，環(huán)六肽內(nèi)酯的合成和大環(huán)的修飾，期間需要大量基因參與。目前僅克隆到了組成PI大環(huán)的第5位L-DMPAPA殘基的生物合成相關(guān)基因（圖1）。該生物合成途徑以分支酸(chorismic acid)為起始底物，在由基因papA、papB、papC和papM編碼的谷酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine aminotransferase)、4-氨基-L-苯丙氨酸(4-amino-L-phenylalanine synthase)、變位酶(mutase)、脫氫酶(dehydrogenase)和甲基化酶(methylase)等酶的參與下完成，其產(chǎn)物L(fēng)-MMPAPA和L-DMPAPA作為前體物質(zhì)分別參與PIB和PIA大環(huán)的合成(3)。PI環(huán)六肽內(nèi)酯的生物合成主要在肽合成酶（peptide synthetase）的催化作用下聚合成肽鏈(4)。目前已分離出催化PI大環(huán)合成的PI合成酶1、2和3的編碼基因snbA、snbC和snbDE（圖2）。這三種酶依次激活PI大環(huán)的1(3-羥基吡啶羧酸)、23 (L-蘇氨酸和D-氨基丁酸)和47位點氨基酸(L-脯氨酸、4-二甲基氨基-L-苯丙氨酸、4-酮-L-六氫吡啶羧酸和L-苯甘氨酸)，合成PIA的前體分子PIE大環(huán)(5;6)?；騭nbF的產(chǎn)物催化第6位L-六氫吡啶羧酸殘基的羥化反應(yīng)修飾PIE大環(huán)形成最終的PIA（圖3）(6)?；騭nbC和snbDE還能激活D-丙胺酸和L-MMPAPA分別連接到PI大環(huán)的第三位和第五位，進(jìn)而形成組分PIC和PIB (5;6)。2.2 普那霉素II的生物合成基因普那霉素IIA由7個乙酸單位、4種氨基酸殘基（纈氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸）、來自絲氨酸的噁唑環(huán)和來自甲硫氨酸的甲基等組成。迄今為止，尚不明確與PII前體的生物合成相關(guān)的功能基因。已鑒定出一個與PIIB環(huán)生物合成的相關(guān)基因snaD，該基因編碼的非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase）可以激活絲氨酸殘基并摻入到PIIB環(huán)中(7)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PIIB的脯氨酸殘基發(fā)生氧化反應(yīng)可轉(zhuǎn)化成PIIA。目前已克隆到參與這一生物學(xué)過程的三個基因snaA、snaB和snaC（圖4）。SnaA和snaB基因編碼PIIA合成酶（pristinamycin IIA synthase）的兩個亞基，snaC基因編碼黃素單核苷酸還原酶（FMN reductase），F(xiàn)MN還原酶提供PIIA合成酶催化反應(yīng)所需的FMNH2(8;9)。3. 普那霉素的抗性基因抗生素產(chǎn)生菌通常含有多個抗性基因，抗性基因是激活生物合成基因轉(zhuǎn)錄的必需成分。在抗生素產(chǎn)生菌體內(nèi)，抗性基因首先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄, 只有當(dāng)抗性已建立后, 生物合成基因的轉(zhuǎn)錄才能進(jìn)行，生物合成基因與抗性基因相互調(diào)節(jié)。同其它抗生素產(chǎn)生菌一樣，S. pristinaespiralis在產(chǎn)生普那霉素時，ptr抗性基因已活躍表達(dá)。ptr是一個多功能抗性基因，它編碼一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，可能通過將抗生素運出細(xì)胞的方式來保護(hù)菌體免受PI、PII和利福平（rifampicin）等三種不同結(jié)構(gòu)抗生素的危害(10;11)。一般來說，抗生素合成基因、抗性基因和調(diào)控基因伴隨在一起表達(dá)。研究表明，當(dāng)鏈霉菌的菌絲生長速率驟然下降時，抗性基因ptr可啟動轉(zhuǎn)錄，此時普那霉素也大量產(chǎn)生(11)。Salah-Bey等還篩選鑒定出一個調(diào)控ptr基因表達(dá)的基因pip，當(dāng)PI存在時，pip結(jié)合在ptr基因的啟動子區(qū)域激活其表達(dá)，反之則抑制其表達(dá)，該基因在多種鏈霉菌中廣泛存在(12)。Blanc等從S. pristinaespiralis中篩選出第二個普那霉素抗性基因snbR，它與ptr基因有70同源性，僅對普那霉素表現(xiàn)抗性 (7)。加強對這個基因的研究將有助于了解在S. pristinaespiralis中存在的不同的抗普那霉素的分子機理。4. 普那霉素生物合成的調(diào)控基因抗生素生物合成過程需要很多調(diào)控基因的作用。目前對普那霉素生物合成進(jìn)行調(diào)控的分子機理還不清楚，僅篩選出兩個功能相關(guān)基因papR1和spbR。基因papR1的編碼產(chǎn)物可正調(diào)控普那霉素的生物合成，該基因缺失使PI和PII的產(chǎn)量下降了30(13)?；騭pbR的編碼產(chǎn)物是papR1基因的正調(diào)控因子，該基因與papR1基因的啟動子結(jié)合后可調(diào)控普那霉素的生物合成，該基因的缺失除導(dǎo)致普那霉素產(chǎn)量大幅度下降外，還嚴(yán)重影響菌體的生長和形態(tài)分化(13)。圖1. 普那霉素I的DMPAPA前體的生物合成途徑(3)圖2. 普那霉素IA、IB和IC組分的結(jié)構(gòu)及PI合成酶的催化位點(6)圖3. 普那霉素IA大環(huán)的合成(6)圖4. 普那霉素IIA大環(huán)的合成(9)5. 普那霉素的生物合成和抗性基因簇一般來說，抗生素生物合成基因成簇排列, 但并不形成一個操縱子, 而是組成幾個不同的轉(zhuǎn)錄單位, 基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄過程中。目前已從S. pristinaespiralis中克隆和鑒定出11個PI或PII的生物合成基因和2個抗性基因，這些基因成簇存在，在染色體上分布于四個不重復(fù)的區(qū)域(14)：（1）A區(qū)只含ptr抗性基因；（2）B區(qū)約40 kb，包括PII生物合成基因snaA、snaB、snaD和PI生物合成基因snbC和snbDE等5個基因；（3）C區(qū)只含PII生物合成基因snaC；（4）D區(qū)包含PI生物合成基因snbA、papA、papB、papC、papM和普那霉素抗性基因snbR等6個基因。由于沒有發(fā)表的S. pristinaespiralis基因組序列，Bamas-Jacques等利用脈沖場電泳(pulsed-field gel electrophoresis)和DNA分子雜交技術(shù)分析了S. pristinaespiralis的染色體特征和上述普那霉素生物合成及抗性基因的遺傳組織狀態(tài)(14)。結(jié)果表明，S. pristinaespiralis的染色體是線性的，核酸大小約7580 kb。存在于染色體上四個不同區(qū)域的普那霉素生物合成及抗性基因被分成兩個基因簇，主要呈現(xiàn)出兩個特征：1. 位于B、C、D區(qū)的所有普那霉素生物合成基因及抗性基因snbR屬于同一基因簇，該基因簇區(qū)約200 kb，占染色體的2.6%（圖5）。在這個基因簇中，PI和PII生物合成基因并不是分別成簇存在，而是分散在整個基因簇，可能與兩類普那霉素的生物合成間的相互協(xié)調(diào)以及鏈霉菌進(jìn)化上的協(xié)同抗性有關(guān)(15)，詳細(xì)機理還有待進(jìn)一步研究。2. ptr抗性基因并不與普那霉素生物合成基因緊密排列，而是單獨位于一個基因簇中。由于基因ptr是一個多抗性基因，它獨立存在于普那霉素生物合成基因簇外可能與對利福平等抗生素的抗性有關(guān)。除此之外，大量的有關(guān)普那霉素生物合成基因簇的重要信息仍需研究探討，如這兩類不同的普那霉素組分生物合成基因形成幾個轉(zhuǎn)錄單位，怎樣進(jìn)行表達(dá)；調(diào)控基因papR1及其正調(diào)控子spbR基因是否也與普那霉素生物合成基因緊密相連，它們怎樣調(diào)控生物合成基因的轉(zhuǎn)錄等。圖5. 普那霉素生物合成基因簇的遺傳組織(14)6. 普那霉素生物合成的基因工程6.1 優(yōu)化普那霉素組分的合成對于普那霉素II，發(fā)酵工業(yè)的主要目標(biāo)產(chǎn)物是PIIA。自然合成的PII型抗生素含有約20的PIIB，PIIB可在基因snaA,B編碼的PIIA合成酶的催化下轉(zhuǎn)化成PIIA。Sezonov等（1997）利用生物技術(shù)的手段來提高胞內(nèi)PIIA合成酶的活性，他們采用一個來自產(chǎn)二素鏈霉菌（S. ambofaciens）的整合型質(zhì)粒pSAM2，將一個拷貝的snaA,B基因轉(zhuǎn)化到S. pristinaespiralis的PI PIIA PIIB型突變體中，該基因在一個強勁的ermE啟動子下得到充分表達(dá)，可將PIIB完全轉(zhuǎn)化為PIIA，得到100PIIA發(fā)酵產(chǎn)物。因此，采用增強基因表達(dá)的手段可以優(yōu)化PIIA的合成。Blanc等利用基因敲除技術(shù)去掉了編碼PIIA合成酶亞基的snaA基因，檢測結(jié)果表明S. pristinaespiralis突變體只有PIIB的積累，沒有PIIA的產(chǎn)生，而PI組分的產(chǎn)生在突變體和野生型中沒有明顯變化(8)。這為抗生素合成過程中基因工程手段的應(yīng)用與化學(xué)合成技術(shù)的結(jié)合提供了新的思路，利用基因工程技術(shù)提供純化的PIIB前體，再利用化學(xué)合成技術(shù)進(jìn)一步合成PIIA。利用基因敲除技術(shù)也為優(yōu)化PI組分的合成提供了新策略。如Blanc等在S. pristinaespiralis的PI PII型突變體中敲除了控制PI前體L-MMPAPA和L-DMPAPA生物合成的關(guān)鍵酶的編碼基因papA，突變體不能形成任何的PI組分，將突變體作為發(fā)酵菌種，當(dāng)向發(fā)酵液中分別添加外源的L-MMPAPA和L-DMPAPA后，在發(fā)酵產(chǎn)物中分別得到單一的PIB和PIA組分(3)。綜上所述，基因工程手段用于生產(chǎn)菌種的改造，結(jié)合化學(xué)合成技術(shù)或發(fā)酵條件的改變可以很好地改進(jìn)普那霉素的合成。6.2 改造普那霉素的代謝途徑合成新型抗生素自然產(chǎn)生的普那霉素難溶于水，很難直接用于臨床。利用化學(xué)合成手段對普那霉素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，形成水溶性的新型普那霉素，可以直接應(yīng)用于臨床(16)。然而，新型抗生素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性對化學(xué)合成提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。近年來，在化學(xué)合成過程中結(jié)合基因工程手段增強了新型抗生素的有效合成。Mahlert等克隆、表達(dá)了普那霉素I大環(huán)的生物合成基因snbDE te，其產(chǎn)物是PI合成酶的具硫酯酶（thioesterase）活性的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可以催化多種肽硫酯鍵的聚合使線性PI分子閉合形成大環(huán)。他們進(jìn)而以獲得的PI大環(huán)分子作為前體，運用化學(xué)合成的方法合成了多種類型的普那霉素衍生物(17)。若直接用普通的化學(xué)合成方法，由于底物分子立體結(jié)構(gòu)的?；远拗屏烁黝惲蝓ユI的形成，因此難以提供豐富的線性PI分子用來合成新型普那霉素。7. 總結(jié)及展望普那霉素作為一種非常有潛力的抗生素，可越來越廣泛地應(yīng)用于臨床。加強對普那霉素代謝途徑的研究可有效地尋找提高產(chǎn)量和優(yōu)化組分的方法。目前，對普那霉素I和II的生物合成途徑還不完全清楚，大量的功能相關(guān)基因還有待挖掘。近十多年來，以利用DNA重組技術(shù)對生物細(xì)胞內(nèi)固有代謝途徑進(jìn)行改造設(shè)計為主要研究內(nèi)容的第三代基因工程，即途徑工程，為普那霉素的代謝工程研究提供了強有力的手段。盡管已有研究者在優(yōu)化普那霉素組分和合成新型普那霉素方面取得了一些成績(17;18)，但離普那霉素的臨床需求和市場化生產(chǎn)還相當(dāng)遙遠(yuǎn)。因此，對普那霉素的途徑工程還應(yīng)該從以下方面加強研究(19;20)：第一，通過增加代謝途徑中關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)、強化基因表達(dá)系統(tǒng)、提高正調(diào)控基因的表達(dá)、抑制負(fù)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和阻斷相競爭的代謝途徑等手段來提高普那霉素的產(chǎn)量。第二，利用基因水平的操作或蛋白水平的改造等手段使鏈霉菌的代謝途徑拓展對底物的專一性，從而達(dá)到獲得新型普那霉素的目的。第三，根據(jù)已知普那霉素生物合成途徑相關(guān)基因以及各步反應(yīng)的分子機制，構(gòu)建含新代謝旁路的高效、經(jīng)濟(jì)價值較大的生產(chǎn)菌株。總之，隨著代謝工程研究的深入，普那霉素在抗生素中的地位和對人類健康的貢獻(xiàn)將日趨提高。參考文獻(xiàn)1. 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