代謝工程概述.ppt

主要參考書 代謝工程 趙學(xué)明等譯 化學(xué)工業(yè)出版社 北京 2003年12月Biotechnology 2nded Vol 1 BiologicalFundamentals RehmH JBBiotechnology 3ndedVol 3 Bioprocessing RehmH JB途徑工程 張惠展 2003基因工程原理 吳乃虎 2004代謝工程 張蓓等 天津大學(xué)出版社 2003 01緒論代謝工程概述 授課教師 李強 本章內(nèi)容 1 1代謝工程的產(chǎn)生和概念的演變 1 2代謝工程的研究內(nèi)容 1 3代謝工程的應(yīng)用領(lǐng)域和前景 第一節(jié)代謝工程的產(chǎn)生和概念的演變 現(xiàn)代生物技術(shù)手段主要包括基因工程 GeneEngineering 細胞工程 CellEngineering 發(fā)酵工程 FermentationEngineering 酶工程 EnzymeEngineering 和生化工程 BiochemicalEngineering 現(xiàn)代生物技術(shù)在化工 醫(yī)藥衛(wèi)生 農(nóng)林牧漁 輕工食品 能源和環(huán)境等領(lǐng)域都將發(fā)揮重要作用 可促進傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造和新型產(chǎn)業(yè)的形成 對人類社會產(chǎn)生深遠影響 其中發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分 是生物技術(shù)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的重要環(huán)節(jié) 20世紀(jì)90年代提出的代謝工程發(fā)展迅速 被視為繼傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)多肽單基因表達 第一代基因工程 基因定向突變 第二代基因工程 之后的第三代基因工程 代謝研究的產(chǎn)生和發(fā)展歷史 微生物發(fā)酵已經(jīng)有幾千年的歷史 早在2000年以前 人們就開始利用微生物進行白酒 黃酒 清酒的發(fā)酵 此時的發(fā)酵為天然發(fā)酵時代 20世紀(jì)40年代 隨著抗生素青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)的大規(guī)模進行 開始了現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)時代 通過自然選擇的方法 人們用10 6的突變幾率來篩選所謂的高產(chǎn)菌株 由于沒有代謝控制發(fā)酵理論作為指導(dǎo) 直到20世紀(jì)60年代現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)仍處于盲目階段 1957年 日本的木下等人開始了谷氨酸的發(fā)酵研究 隨著各國對代謝發(fā)酵理論的深入研究 許多國家轉(zhuǎn)向發(fā)酵菌株本身的研究 獲得了許多的氨基酸高產(chǎn)菌株 隨后 核酸類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)菌也以代謝控制發(fā)酵理論為指導(dǎo)進行選育 并奮起直追成為后起之秀 早期的代謝研究主要內(nèi)容 早期研究中側(cè)重應(yīng)用過程中采用的方法及所達到的目標(biāo) 通常是對細胞特定的代謝途徑進行改造 代謝控制發(fā)酵就是利用遺傳學(xué)的方法或生物化學(xué)方法 人為地在DNA分子水平上改變和控制微生物的代謝 使目的產(chǎn)物大量的生成 積累的發(fā)酵 代謝控制發(fā)酵的核心為 解除微生物代謝控制機制 打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié) 人為地控制微生物的代謝 隨著代謝控制發(fā)酵理論的日臻完善 目前已發(fā)展出一個重要的研究分支 代謝工程 它是近年來分子生物學(xué) 生物化學(xué) 化學(xué)工程學(xué)和計算機科學(xué)的發(fā)展與交差的產(chǎn)物 從而使生物技術(shù)突飛猛進的發(fā)展 使有關(guān)的研究進入了細胞水平 從細胞的代謝途徑出發(fā) 運用工程學(xué)原理進行代謝調(diào)控 使之向產(chǎn)物積累的方向發(fā)展 由此創(chuàng)建了一個新興的領(lǐng)域 即 代謝工程 代謝工程概念演變 代謝工程的現(xiàn)代概念 代謝工程也被人們成為 途徑工程 它屬于基因工程的一個重要的分支 它應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳手段 進行有精確目標(biāo)的遺傳操作 改變酶的功能輸送體系的功能 以改進細胞某些方面的代謝活性的整套操作 包括代謝分析 代謝設(shè)計 遺傳操作 目的代謝活性的實現(xiàn) 是一種生物化學(xué)反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的的修飾 代謝工程的一些基本定義 底物 培養(yǎng)基質(zhì)中的化合物 是能被細胞進一步代謝或直接利用構(gòu)成細胞組分 碳源 氮源 能源物質(zhì)以及滿足細胞功能必須的各種礦物質(zhì)元素均屬于細胞代謝的底物 代謝產(chǎn)物 由細胞合成的化合物 可以是初級代謝產(chǎn)物 二氧化碳 乙醇等 也可以是次級代謝產(chǎn)物或者蛋白質(zhì) 生物基質(zhì)要素 構(gòu)成生物質(zhì)大分子池的一類物質(zhì) 包括DNA RNA 蛋白質(zhì)等 代謝工程的一些基本定義 代謝流和碳骨架物質(zhì)流 代謝物在代謝途徑中流動形成代謝流 在代謝工程領(lǐng)域代謝流往往是指骨架物質(zhì)流 代謝主流 在一定的培養(yǎng)條件下 代謝物再代謝網(wǎng)絡(luò)中流動 流量相對集中的代謝流叫做該條件下的代謝主流 代謝途徑的延伸和改變都會改變代謝主流 從而實現(xiàn)新基質(zhì)的利用和新產(chǎn)品的開發(fā) 代謝主流的測定是代謝工程的重要組成部分 代謝工程的一些基本定義 載流途經(jīng) 代謝主流流經(jīng)的代謝途徑為主要載流途經(jīng) 簡稱載流途經(jīng) 在代謝工程研究中載流途經(jīng)是指碳流在代謝網(wǎng)絡(luò)中通過的主要途徑 代謝主流的變動性和選擇性 生物細胞的代謝主流處于不斷的變化之中 其方向 流量甚至代謝主流的載流途經(jīng)都可能發(fā)生變化 這就是代謝主流的變動性和代謝主流對代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的選擇性 這種變動和選擇的根據(jù)在于生物細胞的遺傳物質(zhì) 選擇的原因在于細胞所處的環(huán)境條件的變化 代謝工程的一些基本定義 代謝途徑定義為 一連串可以進行的并可觀測的生物化學(xué)反應(yīng)步驟 這些反應(yīng)步驟是以指定的一組輸入和輸出代謝物所連結(jié) 代謝工程的一些基本定義 代謝網(wǎng)絡(luò) 在代謝過程中 通過特定的生物化學(xué)反應(yīng) 一些物質(zhì)被分解 從而為基本的生命過程提供能量 同時合成另一些生命所必需的物質(zhì) 發(fā)生在某物種的活細胞內(nèi)所有代謝反應(yīng)構(gòu)成了此物種的代謝網(wǎng)絡(luò) 對蛋白質(zhì)層次的代謝網(wǎng)絡(luò)來說 一個代謝物分子就是一個節(jié)點 而節(jié)點之間的連結(jié)則是生化反應(yīng) 大部分的分子只參加一種或兩種反應(yīng) 但少數(shù)分子參與許多反應(yīng) 它們實際上就是代謝流的集散中心或通用代謝物 代謝工程的一些基本定義 代謝通量定義為 輸入代謝物反應(yīng)生成輸出代謝物的速率 胞內(nèi)代謝通量的確定稱為代謝通量分析 metabolicfluxanalysis MFA 其在代謝工程處于中心地位 代謝工程的一些基本定義 代謝控制分析 MCA etabolicControlAnalysis 簡稱 代謝工程的一個主要目標(biāo)就是對代謝通量控制的理解 其是通過途徑中酶的活性 代謝物 效應(yīng)物和其它參數(shù)所施加的通量控制程度進行定量表述 代謝控制的關(guān)鍵參數(shù)確定以后 人們需要實施這些變化從而最有效地達到預(yù)定目標(biāo) 在實施通量控制的策略中 無論采用哪種路線 為獲得最佳的結(jié)果 都應(yīng)將基因修飾和環(huán)境條件改變結(jié)合起來使用 第二節(jié)代謝工程的研究內(nèi)容 代謝工程的實質(zhì)在于對代謝網(wǎng)絡(luò)進行定量分析 并且在此基礎(chǔ)上進行代謝改造 代謝網(wǎng)絡(luò)重組 以最大限度地提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率 主要內(nèi)容 生物合成相關(guān)代謝調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)理論代謝流的定量分析代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計中心代謝作用機理及相關(guān)代謝分析基因操作 代謝工程研究的目的 通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建具有能合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)或具有高產(chǎn)能力的工程菌 細胞株 生物個體 并用于生產(chǎn)是代謝工程研究的主要目的 代謝網(wǎng)絡(luò)理論 代謝網(wǎng)絡(luò)理論是把細胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體而不是孤立地考慮 細胞代謝的網(wǎng)絡(luò)由上萬種酶催化的系列反應(yīng)系統(tǒng) 膜傳遞系統(tǒng) 信號傳遞系統(tǒng)組成 并且既受精密調(diào)節(jié) 又彼此互相協(xié)調(diào) 代謝網(wǎng)絡(luò)理論是代謝工程研究的基礎(chǔ) 代謝分析 代謝分析是代謝工程的重要組成部分 它涉及代謝流的定量和定向 研究細胞內(nèi)代謝物濃度的反應(yīng)工程方法以及細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)流分析等 代謝工程的實質(zhì) 代謝工程最重要的貢獻在于其強調(diào)在胞內(nèi)條件下代謝通量及其調(diào)控 代謝工程的實質(zhì)是 將通量及其控制進行量化的方法與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來 用以執(zhí)行所建議的基因修飾任務(wù) 當(dāng)反復(fù)利用代謝工程方法時 它就為在很廣范圍內(nèi)系統(tǒng)改進細胞的性質(zhì)提供了一種強有力的方法 通量是細胞生理學(xué)的一個基本決定因素 也是代謝途徑中最重要的參數(shù) 代謝工程與隨機誘變的區(qū)別 盡管定向性從某種意義上來講是所有菌種改進工作的固有特性 但是代謝工程與隨機誘變相比 其工作焦點致力于定向性 以致其在目標(biāo)酶的選擇 實驗設(shè)計以及數(shù)據(jù)分析等方面都起著重要的作用 另一方面 細胞的定向改進應(yīng)解釋為合理的途徑設(shè)計與修飾 因此在這個意義上說 代謝工程與隨機誘變是完全不同的 實際上 通過隨機誘變而得到的性能優(yōu)良的菌株能夠作為關(guān)于途徑結(jié)構(gòu)與控制方面重要信息的來源 這可經(jīng)由反向代謝工程獲取 代謝工程也包括兩個明確的步驟 即分析與合成 因為代謝工程是隨著DNA重組而出現(xiàn)的可行技術(shù) 所以最初代謝工程幾乎都集中于這個領(lǐng)域的合成方面 如在各種宿主細胞中新基因的表達 內(nèi)源酶的擴增 基因的缺失或酶活性的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄的或酶的解除調(diào)控等 因此 代謝工程在很大程度上曾是應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)體現(xiàn) 而很少帶有工程方面的內(nèi)容 代謝工程的主要特征 代謝工程的主要特征就是利用DNA重組技術(shù) 重建代謝網(wǎng)絡(luò) 改變代謝流及分支代謝速度 以改進代謝產(chǎn)物及蛋白類產(chǎn)品 由于外源DNA的引入擴展了固有的代謝途徑 獲得了新的化學(xué)物質(zhì) 改變轉(zhuǎn)化蛋白的過程 減少不必要的廢物 代謝工程研究的主要問題 提高細胞已有的代謝途徑中天然產(chǎn)物的產(chǎn)量改變細胞已有代謝途徑 合成新產(chǎn)物對不同細胞的代謝途徑進行整合 構(gòu)建全新的代謝途徑優(yōu)化細胞的生物學(xué)特性 如生長速率 耐受性等 代謝工程的研究手段 1 采用遺傳學(xué)手段的遺傳操作 1 基因工程技術(shù)的應(yīng)用 2 常規(guī)誘變技術(shù)的應(yīng)用2 生物合成途徑的代謝調(diào)控 1 生物合成中間產(chǎn)物的定量生物測定 2 共合成法在生物合成中的應(yīng)用 3 酶的誘導(dǎo)合成和分解代謝產(chǎn)物阻遏 4 無機磷對生物合成的調(diào)節(jié)3 研究生物合成機制的常用方法 1 刺激實驗法 2 同位素示蹤法 3 洗滌菌絲懸浮法 4 無細胞抽提法 5 遺傳特性誘變法 代謝工程的研究方法 1分子生物學(xué)方法 構(gòu)建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 尤其對于具有較高生產(chǎn)價值的微生物 具有重要意義 例如Backman等利用切割載體獲得Tyr營養(yǎng)突變型 為構(gòu)建苯丙氨酸的生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ) 2分析化學(xué)及檢測方法 代謝工程的研究對象是代謝途徑 因此必須對代謝通路中的一些酶及產(chǎn)物進行研究和分析 傳統(tǒng)的分析通路阻斷的手段有 物質(zhì)平衡 同位素標(biāo)記 分析障礙突變體等 目前它們?nèi)匀皇潜夭豢缮俚氖侄?而核磁共振 流氏細胞術(shù)的應(yīng)用則為這一領(lǐng)域的發(fā)展增添了新的活力 3數(shù)學(xué)及計算機工具 研究代謝工程不僅需要遺傳學(xué)知識 而且需要對宿主菌的生化代謝途徑和生理學(xué)有深入的理解 所以將DNA數(shù)據(jù)庫的信息應(yīng)用于代謝工程并開發(fā)出適合的軟件系統(tǒng)是十分必要的 Karp等構(gòu)建了981個生命體化合物數(shù)據(jù)庫 為未來的發(fā)展奠定了基礎(chǔ) 人們已在實驗的基礎(chǔ)上結(jié)合數(shù)學(xué)和化學(xué)的理論 發(fā)展了一些人工智能程序 代謝工程的基本過程 1 代謝分析與代謝設(shè)計 代謝工程的研究對象是代謝途徑 因此必須對代謝網(wǎng)絡(luò)中的一些酶及產(chǎn)物進行研究和分析 根據(jù)代謝流的分析確定代謝設(shè)計的合理靶點 設(shè)計合適的代謝工程操作手段 對于靶點進行改造 達到改造代謝的目的 代謝工程的基本過程 2 基因操作 代謝改造的核心是在分子水平上對于靶基因或基因簇進的克隆 表達 修飾 敲除 調(diào)控 構(gòu)建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及重組基因在細胞染色體DNA上的穩(wěn)定整合 代謝工程的基本過程 3 效果分析 通常一次性的代謝設(shè)計和基因操作往往不能達到實際生產(chǎn)所要求的產(chǎn)量 速率或濃度 因此對于一次代謝改造的效果分析 得到本次操作的優(yōu)點和缺點數(shù)據(jù) 改進缺陷 綜合優(yōu)勢 進行下一次代謝改造 經(jīng)過不斷的改造和分析 可以得到好的結(jié)果 代謝工程的三個基本觀點 隨著生物化學(xué) 細胞生物學(xué) 應(yīng)用分子生物學(xué) 遺傳工程和代謝工程的發(fā)展 工業(yè)發(fā)酵正在經(jīng)歷一個從技藝到科學(xué)的重大變化 正在向微生物生物工程過渡 在生物工程受到廣泛重視的今天 有必要把微生物 菌種選育 微生物學(xué)過程 發(fā)酵工藝 和微生物學(xué)體系 生物反應(yīng)器 作為一個整體 在科學(xué)的水平上對工業(yè)發(fā)酵進行重新審視 代謝工程的三個基本觀點 從工業(yè)發(fā)酵的現(xiàn)狀出發(fā) 主要根據(jù)對碳元素代謝及其控制 菌種是化能異養(yǎng)型微生物 產(chǎn)物是微生物細胞排出細胞的代謝中間產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵 提出了3個基本觀點 代謝工程的三個基本觀點 1 1生物能支撐觀點微生物細胞是工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)者 微生物細胞的生長和維持需要由其自身的能量轉(zhuǎn)換機構(gòu)或從其他形式的能量轉(zhuǎn)化形成的生物能來支撐 因此 工業(yè)發(fā)酵具有生物學(xué)屬性 1 2代謝網(wǎng)絡(luò)觀點由生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)和跨輸送步驟組成的代謝網(wǎng)絡(luò)既沒有絕對的起點 也沒有絕對的終點 代謝網(wǎng)絡(luò)中任何一種中間產(chǎn)物 或可借助生物學(xué) 化學(xué)方法與代謝網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)的任何一種化合物 都可能被開發(fā)成為工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物或原料 1 3細胞經(jīng)濟觀點微生物細胞的經(jīng)濟性是在自然選擇的過程中逐漸形成的 野生的 未經(jīng)人工變異的 微生物細胞在自然選擇的過程中逐漸形成競爭型的細胞經(jīng)濟 而工業(yè)發(fā)酵往往要以目的產(chǎn)物的生產(chǎn)為主導(dǎo) 調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝流 構(gòu)建一種導(dǎo)向型細胞經(jīng)濟 從競爭型細胞經(jīng)濟的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于遺傳和環(huán)境因素的信息導(dǎo)向 這種導(dǎo)向必須遵循細胞經(jīng)濟的基本運行規(guī)律 代謝工程研究的設(shè)計思路 在具體的設(shè)計和操作中 一般從以下方面著手 1 提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流 2 擴展代謝途徑 3 構(gòu)建新的代謝途徑 提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流的手段通常有 a 增強催化限速反應(yīng)的酶的表達量或活性 從而提高代謝流 b 在有競爭途徑 如分支代謝途徑 存在時 阻斷有害的或無關(guān)的競爭代謝途徑代謝產(chǎn)物的合成 從而達到改變代謝流 提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的 擴展代謝途徑一般是指通過基因工程手段引入外源基因 簇 等 使原有代謝途徑進一步向前或向后延伸 從而可利用新的原料用于合成目標(biāo)產(chǎn)物或產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物 構(gòu)建新的代謝途徑一般是指引入外源基因 簇 來改造和修飾代謝網(wǎng)絡(luò) 使細胞從不能合成某種代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚝铣纱舜x產(chǎn)物 常用的手段有 a 轉(zhuǎn)移代謝途徑 即將多個特定代謝途徑中的相關(guān)基因 簇 轉(zhuǎn)移到無這些基因的菌株 或植物細胞等 中 從而達到使其能合成新的目標(biāo)產(chǎn)物的目的 b 將無關(guān)的代謝途徑相連 形成新的代謝途徑 從而合成新的目標(biāo)產(chǎn)物 習(xí)題 etabolicControlAnalysis 簡稱 第三節(jié) 代謝工程的應(yīng)用領(lǐng)域和前景 代謝工程和微生物發(fā)酵工業(yè)要解決的根本問題是 如何有效地改造微生物菌種 使其高效地發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)品 代謝工程是利用基因工程技術(shù)改造細胞的代謝 以改善細胞的性能的一門新興學(xué)科 2003年美國貝克萊大學(xué)J Keasling 采用酵母細胞表達天然植物藥箐篙素分子 實現(xiàn)工程微生物代謝工程制藥 采用系統(tǒng)生物學(xué)原理和轉(zhuǎn)基因生物技術(shù) 計算機軟件輔助設(shè)計技術(shù) 將細胞內(nèi)次生代謝反應(yīng)鏈重新設(shè)計 人工合成基因與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 從而進入了代謝工程 基因工程的合成生物學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)基礎(chǔ)的遺傳工程時代 代謝工程的主要目標(biāo)是識別特定的遺傳操作和環(huán)境條件的控制 以增強生物技術(shù)過程的產(chǎn)率及生產(chǎn)能力 或?qū)毎再|(zhì)進行總體改性 本書最主要的內(nèi)容包括途徑集成和把代謝通量作為細胞生理學(xué)的基本決定因素來考慮的重要性 代謝工程把數(shù)學(xué)的復(fù)雜性減到最小 并同時提供一些必要的補充說明作為不同數(shù)學(xué)運算的背景材料 發(fā)酵產(chǎn)品 代謝工程研究的第一步必然是先確定要發(fā)酵生產(chǎn)什么產(chǎn)品 微生物發(fā)酵產(chǎn)品主要分為3大類 可再生能源 大宗化學(xué)品 和生物材料 精細化合物 可再生能源類目前研究的比較多的是纖維素乙醇 生物柴油 丁醇 然而目前的生物能源有著很多缺陷 將來很有必要開發(fā)品質(zhì)高 原材料豐富的下一代生物能源 如長鏈醇 油酯和碳氫化合物 大宗化學(xué)品類目前研究比較多的是檸檬酸 溶劑 乳酸 聚羥基烷酸 1 3 丙二醇 丁二酸以及這些化學(xué)品聚合生產(chǎn)的生物材料 如生物塑料 生物橡膠 然而目前能工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的大宗化學(xué)品數(shù)量還非常有限 將來很有必要繼續(xù)開發(fā)生產(chǎn)新型大宗化學(xué)品的代謝工程菌 全方位地使生物制造技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化工制造技術(shù) 3 羥基丙酸 丙烯酸 二羥基酸類 天冬氨酸 糖醇類 1 2 丙二醇 1 4 丁二醇的代謝工程菌改造有希望在短期內(nèi)取得重大突破 精細化合物目前研究比較多的是