6 中藥緩控釋給藥系統(tǒng)的質(zhì)量綜合評價.doc

6 中藥緩控釋給藥系統(tǒng)的質(zhì)量綜合評價中藥緩控釋給藥系統(tǒng)的質(zhì)量評價體系包括制劑體外質(zhì)量評價、體內(nèi)評價及體內(nèi)外釋藥的相關性考查。體外質(zhì)量評價包括制劑學常規(guī)項目的檢查，如片劑的外觀、片重差異等，小丸的水分、圓整度、重量差異等，微球的外觀特性、粒度分布、流動性等；定性檢查，包括化學特征反應檢識、薄層色譜檢識等；指標成分的定量測定；體外釋放度的測定。體內(nèi)評價包括藥代動力學、藥效動力學、生物利用度。體外質(zhì)量評價除體外釋放度的測定外，其余檢測項目與普通制劑相同，在此不再累述。6.1體外釋放度的測定 釋放度（releasing rate）是緩控釋制劑中藥物在規(guī)定介質(zhì)中釋放的速度和程度。釋放度與溶出度（dissolution rate）本質(zhì)上是相同的，但在具體測定方法與條件方面兩者有一定的差別。緩控釋制劑的體外釋放度測定是模仿緩、控釋制劑在胃腸道內(nèi)的運轉狀態(tài)及胃腸道環(huán)境制定的，是篩選緩、控釋制劑處方和控制其質(zhì)量的重要手段。 6.1.1體外釋放度測定方法及判斷標準轉籃法（stirring basket method）與漿法(stirring paddle method)是兩種最基本和最常用的釋放度測定方法，對于大多數(shù)中藥緩控釋制劑，由于其有效成分含量低，宜采用小杯法測定。各種方法的儀器裝置、測定方法及結果判斷可參考中國藥典（二部）附錄溶解度測定法。中國藥典和美國藥典2000年版釋放度測定方法及判斷標準對比見表6-1。美、日、德對緩控釋制劑釋放度測定的具體規(guī)定對比見表6-2表6-1 中美兩國2000版藥典中口服固體緩釋制劑釋放度測定對照表中國（CP2000）美國（USP24）裝置1 轉籃法2 漿法3 小杯法（相當于USP24中的方法7，既可用于緩控釋制劑也可用于透皮給藥系統(tǒng)）1 轉籃法（stirring basket method） 2 漿法(stirring paddle method)3 往復筒法（reciprocating cylinder）4 流通池法（flow through cell、用于緩釋制劑）5、6 用于透皮給藥系統(tǒng)7 往復夾法（reciprocating holder兩者均適用）釋放介質(zhì)介質(zhì)：首選脫氣的新鮮蒸餾水溫度：37體積：250、500、750、900、1000mL離子及離子強度：PH：表面活性劑：溫度：37取樣時間點及各時間點釋藥量釋放全過程的時間不應低于給藥的間隔時間，且累積釋放率要求達到90%至少三個取樣點：第一點開始0.5-2小時，用于考察藥物是否有突釋（累積釋放量約30%）；第二點為中間取樣時間t（累積釋放約50%），用于確定藥物的釋藥特性；最后取樣點t（累積釋放約75%），考察藥量是否基本釋放完全。至少三個時間點：最初時間點（early time point）,證明藥物沒有完全釋放，保證用藥安全性;中間時間點（middle time point），應能較好地反映釋藥特性；最終時間點（final time point），應顯示滿意的釋放量；判斷標準除另有規(guī)定外，應符合下列有關規(guī)定：6片（個）各時間測得的釋放量按標示量計算均應符合規(guī)定。如各時間測定值有1片（個）不符合規(guī)定范圍但其平均釋藥量均符合規(guī)定范圍，仍符合規(guī)定。如最后時間釋藥量有1片（個）低于規(guī)定值10%者，則另取6片（個）復試。初復試12片（個），其平均釋藥量均符合各時間規(guī)定范圍，且最后釋藥量低于規(guī)定值10%者不超過2片（個），亦符合規(guī)定。6片（個）中每片（個）各時間測得的釋放量按標示量計算均應符合規(guī)定；若有不符合規(guī)定者，另取6片（個）測定，兩次測試的12片（個）平均釋放量均符合各時間規(guī)定范圍，其中沒有超出規(guī)定范圍10%和低于最終釋放量規(guī)定值10%的片（個），可判為符合規(guī)定；12片（個）測試仍不符合者，再取12片（個）測定，三次測定的24片（個）平均釋放量均符合各時間規(guī)定范圍，其中超出規(guī)定范圍10%的片（個）2，且沒有超出規(guī)定范圍20%或低于最終釋放量規(guī)定值20%的片（個），仍可判為符合規(guī)定。表6-2 美、日、德對緩控釋制劑釋放度測定的具體規(guī)定對照表美國日本德國在極端的生理條件下進行溶出實驗在盡可能多的不同條件下測定3種PH條件下測定溶劑PH值1.0-4.0-6.0-7.4溶劑PH值1.2-4.0-6.8溶劑PH值1.2-4.0-6.8或7.4遇到難溶藥物不用有機溶劑而是加入表面活性刑(SDS)至少2種攪拌強度(50100200rmin)至少2種攪拌強度至少3次取樣1h，t(50)，t(80)考察藥品潤濕性和離子強度的影響換用另種溶出方法測定(槳法、籃法互換)考察溶劑中加入表面活性劑或油性成分(如脂肪)的影響考察其它成分如酒、酶等的影響換用另種溶出方法測試6.1.2影響釋放度的因素及其控制影響釋放度的主要因素除藥物制劑本身固有的性質(zhì)外還可由溶出儀、溶出介質(zhì)及取樣引起，這些影響因素可分為流體動力學因素、溶出介質(zhì)物理化學性質(zhì)及固液介面動力學因素，詳見表6-2。表6-2 影響釋放度的因素影響因素流體動力學溶出介質(zhì)理化性質(zhì)固液介面動力學制劑性質(zhì)藥物與溶出介質(zhì)的反應樣品位置、制劑形狀、藥物的溶解及崩解、顆粒大小及比重、處方輔料儀器系統(tǒng)攪拌裝置的位置、攪拌速率、系統(tǒng)的振動和扭動、密合度、偏心率溶出介質(zhì)多余介質(zhì)的返回、介質(zhì)的換用及介質(zhì)的補充、介質(zhì)中的氣體表面張力、溫度、PH值、體積介質(zhì)中氣體取樣取樣管位置6.1.2.1制劑性質(zhì)的影響 制劑的固有性質(zhì)主要是由制劑處方、工藝決定的，其中輔料的種類和用量是影響釋放度的主要因素。可根據(jù)緩控釋制劑的釋藥要求選用不同的輔料（阻滯劑、致孔劑、崩解劑等）來控制藥物的釋放，達到緩控釋的目的。6.1.2.2儀器系統(tǒng)的影響6.1.2.2.1儀器系統(tǒng)的振動系統(tǒng)振動是釋放度測定中的常見影響因素，分為系統(tǒng)振動和偶然振動。系統(tǒng)振動是由系統(tǒng)中交流電源產(chǎn)生的振動，系統(tǒng)振動難以消除，對于同一制劑，最好采用同一型號的儀器，以減少系統(tǒng)誤差。偶然振動是由于外界振動源通過水浴或溶出儀框架傳遞給溶出杯，從而影響制劑釋放度的振動，如環(huán)境中的空調(diào)設備、風扇，同一工作臺上的離心機、UV分光光度計、泵等。偶然振動會引起測定數(shù)據(jù)的不規(guī)則變化，應盡量避免，不容忽視。6.1.2.2.2偏心率偏心率是系統(tǒng)中影響制劑釋放度的又一因素，偏心率是攪拌軸的旋轉軸線與溶出杯的軸線之間偏離的程度，USP規(guī)定不得大于2mm，中國藥典規(guī)定不得大于1mm。一般情況下，偏心率越大，釋放越快，為避免偏心率引起的試驗結果重現(xiàn)性差、穩(wěn)定性低，測定之前必須對每個溶出杯進行定位，校準攪拌器。6.1.2.2.3轉動速度轉動速度對制劑的釋放度也有較大的影響，研究表明，轉速的變化與釋放速率基本上呈線性關系，攪拌速度一般在50-100r/min，漿法50r/min相當于轉籃法100r/min。轉速的選擇要根據(jù)制劑的劑型特性及所選用的方法來確定。6.1.2.3溶出介質(zhì)的影響6.1.2.3.1溶出介質(zhì)的種類 新鮮蒸餾水應作為首選溶出介質(zhì)，在USP中近500個品種的溶出度試驗以水為溶出介質(zhì)，其中只有一個出現(xiàn)了生物不等效性。其次，在水中加入鹽酸或醋酸使其與人體胃酸環(huán)境相似的介質(zhì)，與生物利用度也有較好的相關性。另一種是在水中加入緩沖劑，PH值一般為3.0-8.0，多采用PH7.4的緩沖液，F(xiàn)DA規(guī)定以PH6.8代替PH7.4，此PH值與人體腸液相似，更符合藥物經(jīng)口服后的體內(nèi)環(huán)境。對于水溶性較差的藥物，可在介質(zhì)中加入表面活性劑，如十二烷基磺酸鈉(0.5%以下)，也可選擇適宜的有機溶媒(如異丙醇、乙醇（濃度10%以下，不得超過30%）)與水的復合介質(zhì)，最好不用氫醇類的溶出介質(zhì)。選用表面活性劑或有機溶媒作介質(zhì)，可能存在體內(nèi)外不相關，并不能客觀地反映制劑的體內(nèi)生物利用度，要慎重選擇這類介質(zhì)的種類及其濃度范圍。6.1.2.3.2溶出介質(zhì)中的氣體 在測定釋放度時，溶出介質(zhì)必須經(jīng)脫氣處理，以減少其中所溶解的氣體對藥物釋放產(chǎn)生物理和化學的干擾。1 物理干擾影響篩網(wǎng)的孔隙率 當介質(zhì)中的氣體受熱逸出時，常常吸附于轉籃、轉軸或旋漿等表面，從而在轉籃上形成一層氣體屏障，減少轉籃孔隙率，阻礙藥物或小顆粒從轉籃向杯中擴散。吸附在轉軸或旋漿上的氣體對藥物的釋放影響較小。影響介質(zhì)流型 當溫度升高時，氣體在介質(zhì)中的溶解度降低，氣體以小氣泡的形式釋放，從下向上逸出，改變了介質(zhì)的流型。吸附在容器壁上的氣泡也能引起杯壁介質(zhì)流型的改變。2 化學干擾 改變介質(zhì)PH值 當以蒸餾水為介質(zhì)時，溶解在其中的CO2引起介質(zhì)PH的改變，尤其對PH溶解曲線變化大的藥物，更不能忽視。在緩沖液中，溶入的氣體對PH的影響較小。氧化 一些易氧化的物質(zhì)在釋放度的測定過程中，溶解在介質(zhì)中的O2會明顯影響測定結果。對易氧化的藥物，必須進行脫氣操作，必要時可先通入惰性氣體排除O2，再脫氣處理。6.1.2.3.3溶出介質(zhì)的溫度 溫度對釋放度的影響大小取決于藥物和制劑輔料的溫度-溶解度曲線。人體溫表正常溫度為37，為了能更準確地反映體內(nèi)的情況，各國藥典均規(guī)定溶出介質(zhì)的溫度為37，中國藥典規(guī)定溶出介質(zhì)溫度為370.5，6個溶出杯中的溶出介質(zhì)溫度誤差在0.5范圍之內(nèi)，以保證數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。6.1.2.3.4溶出介質(zhì)的體積 選擇釋放介質(zhì)體積的一個重要標準是漏槽狀態(tài)（sink condition），即藥物所處釋放介質(zhì)的濃度遠小于其飽和濃度，實際應用中，USP24中規(guī)定為小于飽和濃度的1/3。目前各國藥典采用的釋放度測定方法（流通池法除外），溶出介質(zhì)體積一般為500-1000ml，大多為900或1000ml，對于一些劑量小，有效成分含量低的藥物，中國藥典增加了小杯法，介質(zhì)體積減少至100-250ml。6.1.2.4取樣的影響 取樣的位置對釋放度的測定也有一定影響，溶出杯內(nèi)的藥物濃度可能不相同，中國藥典規(guī)定的取樣位置是在轉籃或漿葉上端距液面中間，離溶出杯壁10mm處。小杯法取樣點應在漿葉上端距液面中間，離杯壁6mm處。USP對取樣點的要求與中國藥典不相同，USP僅規(guī)定取樣點在轉籃頂部到溶出介質(zhì)液面之間，距離杯壁不得低于1cm，但各次取樣必須在同一位置。USP還規(guī)定取樣時間必須控制在2%誤差之內(nèi)。 6.2 藥代動力學研究中藥藥代動力學（Pharmaxokinetics, PK）是利用動力學原理及數(shù)學方法，定量地描述中藥有效成分、有效部位、單味中藥或中藥復方通過各種給藥途徑進入機體后的吸收、分布、代謝和排泄等過程的動態(tài)變化規(guī)律。通過中藥緩釋劑體內(nèi)動力學研究，探討制劑中有效物質(zhì)在體內(nèi)的釋放規(guī)律、作用機理及藥動力參數(shù)，有利于指導中藥緩釋劑處方的設計、制備工藝的優(yōu)化和輔料的篩選，有利于擬定臨床給藥方案，確定給藥劑量、給藥間隔時間及療程，從而提高中藥制劑的質(zhì)量和療效，對實現(xiàn)中藥的現(xiàn)代化有著重要的作用。對于中藥緩釋制劑的藥代動力學研究，原則上應考慮：與普通制劑比較，中藥緩釋制劑除在體外溶出試驗中具有緩釋特性外，在體內(nèi)也應有緩釋特性。中藥緩釋制劑可選用藥代動力學方法或藥效動力學方法證明其在體內(nèi)的緩釋特性。建議首選藥代動力學的定量測定方法。對于確實無法建立符合生物樣品分析要求的體內(nèi)藥物測定方法的，可采用藥效動力學方法進行研究，但必須充分說明理由。用藥效動力學方法進行研究時，必須嚴格遵循藥理學試驗設計的要求。對于動物實驗，建議采用交叉設計。藥效指標應客觀，能定量，有明確的量效關系，能反映臨床的主要適應證，并能確切地證實體內(nèi)的緩釋特性。藥代動力學研究時，可選擇緩釋制劑和對應的普通參比制劑中至少一個相同的有效成分，該成分能夠反映藥物的主要藥效。該成分的含量穩(wěn)定，制劑中成分可控。并能夠建立符合生物樣品分析要求的體內(nèi)藥物測定方法。以中藥有效成分制備的中藥緩釋制劑的體內(nèi)藥代動力學研究，應參照化學藥緩釋制劑的要求進行。以中藥有效部位制成的中藥緩釋制劑或以有效成分（或部位）組成的復方制備的中藥緩釋制劑的體內(nèi)藥代動力學研究，應選擇至少一種能夠反映主要藥效的有效成分進行藥代動力學研究，體內(nèi)外試驗應證明與普通參比制劑比較，具有緩釋特性。6.2.1中藥緩釋劑藥代動力學的研究方法及評價中藥緩釋劑藥代動力學的研究方法與化學藥品的藥代動力學研究沒有本質(zhì)的區(qū)別，其方法分為有效成分的藥代動力學方法和生物效應法（藥理效應法、藥物累積法、效量半衰期法）。6.2.1.1有效成分的藥代動力學法（體內(nèi)藥物濃度法）本法適于化學成分比較明確的制劑，與化學藥物的藥代動力學研究原理類似，常采用分光光度法、色譜法等測定中藥已知成分在血、尿或其它組織的濃度，研究其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄。隨著近年來分離分析檢測方法的發(fā)展，血藥濃度法具有簡單、快速的特點,被廣泛使用。但如果認為某種有效成分的動力學特點即可反映整個中藥制劑的動力學特征，顯然是過于簡單化了。中藥成分復雜，特別是復方中藥，不同于結構明確、成分單一的化學藥品，即使是單味中藥也是由多種成分組成的小復方，有效成分難以確定。同一種有效成分在不同中藥中所處環(huán)境不同，其藥代動力學參數(shù)各異，龐志功等證明牡丹皮和徐長卿中丹皮酚的藥動學參數(shù)有顯著性差異。同種中藥中的不同種有效成分，由于結構不同，其藥代動力學參數(shù)也不同。單一成分與其在藥材或復方中的藥動學參數(shù)不同，有人證明黃連素單體與黃連藥材中黃連素的藥代動力學參數(shù)有顯著性差異。所檢測成分并非是該制劑的唯一有效成分，并不能代表整個制劑的藥動學。故在中藥緩釋劑的藥動學研究中，觀測指標的選擇應以該制劑的功能主治為指導，盡量多地選用與功能主治直接相關的成分進行測定，以便更客觀地反映制劑的整體藥動學過程。6.2.1.2生物效應法生物效應法主要包括藥理效應法、藥物累積法(動物急性死亡率法)和微生物法，對于有效成分不明，缺乏微量、定量檢測方法的制劑可采用此法。在中藥緩釋劑動力學研究中，應用最多的是藥理效應法，由于緩釋劑釋藥緩慢，其本身的毒性較普通制劑小，再加上中藥的毒性相對較低，在多數(shù)情況下難以測得動物的急性死亡率，用藥物累積法測定中藥緩釋劑的動力學參數(shù)存在一定的難度；對于具有抗菌作用的中藥，一般不要求制成緩釋劑，故微生物法應用也較少。藥理效應法符合中醫(yī)藥理論，體現(xiàn)了整體觀念。雖然藥理效應法從整體上反映該制劑的動力學特征，但也存在著缺點：生物個體差異大，測定方法準確度和精密度差，測定的參數(shù)具有一定的表觀性。由于中藥具有多作用的特點，實際上以某種藥理效應強度為指標也并非能反映該制劑的動力學特征，指標不同，所得藥動學參數(shù)可有較大差異，所以觀察指標應是藥物的主要作用，盡可能與臨床用藥目的一致。6.2.2中藥緩釋劑藥動學研究存在的難點 中藥緩釋劑藥動學研究在不斷向廣度和深度發(fā)展，但在整個研究過程中存在著普遍的問題：血樣的處理 藥物成分從血樣中的提?。ǚ蛛x、純化、富集）是藥動學（特別是用血藥濃度法研究）的首要步驟，血樣處理方法的選擇直接關系到測定結果的準確性。中藥是多成分的復雜體系，各成分的化學性質(zhì)有較大的差異，如何將性質(zhì)不同的化學成分同時分離、富集是首先要解決的問題。作者認為對于中藥緩釋劑，在不同的時間，其釋放的藥物的量和質(zhì)不一定完全相同，同一種處理方法并非完全適于不同時間點的血清樣品，這種觀點有待商榷。中藥有效成分含量低，服用后在體內(nèi)經(jīng)過一系列的變化（肝臟代謝、酶、細菌的分解、與血紅蛋白結合等），使有效成分濃度進一步降低，由于緩釋劑的釋放是限速過程，有效成分一旦釋放，就很快在機體內(nèi)發(fā)生各種變化，有時即使用靈敏度高的儀器也難以檢測出來。中藥成分復雜，各成分間相互影響，指標的選擇存在一定的難點。6.2.3中藥緩釋劑藥代動力學研究的發(fā)展趨勢 中藥緩釋劑動力學的研究，應借鑒西藥動力學原理和方法，吸取現(xiàn)代科學知識，在中醫(yī)藥理論指導下，不斷進行理論和技術創(chuàng)新，采用多學科相互交差、相互滲透、集藥理學、天然藥物化學、分析化學各科所長，構建中藥緩釋劑動力學研究的理論與技術體系。隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，中藥緩釋劑的藥代動力學研究也取得了一些經(jīng)驗。由于有效成分藥代動力學法與藥理效應法各自存在著優(yōu)缺點，目前，中藥緩釋劑的動力學研究正在向著藥代動力學（Pharmaxokinetics, PK）-藥效動力學（Pharmacodynamics, PD）即PK-PD相結合的模型方向發(fā)展。從整體動物、組織器官、細胞亞細胞和分子生物學四個水平進行藥動學研究，闡明中藥多成分、多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)整合調(diào)節(jié)的特色。某些藥中含有毒性成分，應分別針對有效成分和毒性成分進行動力學研究，有效成分呈現(xiàn)的療效與毒性成分呈現(xiàn)的毒效，二者相伴存在，在中藥緩釋劑的研究中應引起重視。藥代動力學-藥效動力學相結合、有效成分-毒性成分動力學相結合的研究，將進一步解決中藥制劑的有效性、安全性、可控性問題,對推動中藥緩釋劑的現(xiàn)代化、國際化起著舉足輕重的作用。6.3 藥效動力學中藥復方成分復雜, 不同于結構明確、單一成分的西藥,各成分之間相互影響,同一種有效成分在不同中藥中因所處環(huán)境不同,藥代動力學參數(shù)各異,不同種有效成分在同種中藥中由于結構不同,藥動學參數(shù)也不同。因此不能以單一成分的血藥濃度來表示該藥的體內(nèi)過程。藥代動力學（Pharmaxokinetics,PK）-藥效動力學（Pharmacodynamics,PD）（PKPD）相結合是較理想的模型,更能有效地解釋中藥多成分、多作用、多靶點發(fā)揮綜合療效的特征,體現(xiàn)藥物在機體的作用規(guī)律及藥物的動態(tài)變化規(guī)律。藥效動力學（Pharmacodynamics,PD）6.4生物利用度與生物等效性（緩控釋制劑人體生物利用度及其申報要點）生物利用度（bioavailability, BA）是指藥物吸收進入血液循環(huán)的速度與程度。生物利用度包括生物利用速度（extent of bioavailability, EBA）與生物利用程度（rate of bioavailability, RBA）兩方面的內(nèi)容。生物利用速度是指藥物吸收進入體循環(huán)的快慢，可用吸收速率常數(shù)（Ka）或平均吸收時間（MAT）表示，常用達峰時間（tmax）比較制劑間吸收的快慢；生物利用程度指藥物吸收進入體循環(huán)的多少，可用血藥濃度-時間曲線下的面積（AUC）表示。生物利用度是衡量制劑療效差異的重要指標，不同制劑 、不同藥廠生產(chǎn)的同一制劑、同一藥廠生產(chǎn)的同一制劑的不同批號間的臨床療效都有可能不一樣，大量研究表明，制劑的處方、制備工藝、給藥途徑等是影響制劑生物利用度的主要因素。生物利用度分為絕對生物利用度（F）和相對生物利用度（Fr），前者指同一藥物經(jīng)靜脈注射與血管外給藥進行比較，假定靜脈注射的生物利用度為100%，后者指同種藥物的不同制劑，在同一給藥途徑下進行比較。6.4.1緩控釋制劑生物利用度研究實驗設計緩控釋制劑生物利用度研究是證明研究的緩控釋制劑是否與普通制劑生物利用程度相等?？疾炀徔蒯屘攸c，檢查藥物有無突釋現(xiàn)象。緩控釋制劑的生物利用度研究需進行單劑量試驗與多劑量試驗。6.4.1.1單劑量試驗 單劑量試驗考察緩控釋制劑體內(nèi)藥物釋放行為，評價與參比制劑吸收速率與吸收程度的差異，考察體內(nèi)吸收與體外釋放的相關性。一般采用二處理（two treatment）、二周期(two period)、二順序隨機交叉試驗。二處理也稱處方間，即指受試制劑與參比制劑，二周期又稱二階段，二周期間稱為洗凈期（washout period），應大于藥物的7-10個半衰期，通常為一周。二順序指一組先服用受試制劑，后服用參比制劑，另一組先服用參比制劑而后服用受試制劑。6.4.1.2多劑量試驗多劑量穩(wěn)態(tài)研究用于考察在連續(xù)給藥的條件下，受試制劑藥物吸收速率、吸收程度及血藥濃度波動情況，并與參比制劑進行比較，試驗采用二處理、二周期、二順序隨機交叉試驗，緩控釋制劑按設計要求給藥（如每天1次或2次），若參比制劑為普通速釋制劑、則按臨床常規(guī)方法給藥（如每天2次或3次），但兩種制劑一天服藥總劑量應相等，一般連服一定時間（不得少于待測藥物7個半衰期）后，開始測定谷濃度，至少測3次，以確證達到穩(wěn)態(tài)。連續(xù)3次谷濃度的采樣時間應固定在每天同一時間，一般為每天早上給藥前，6.4.1.3高脂飲食的影響試驗高脂飲食影響試驗是考察食用高脂飲食后服用受試制劑與參比制劑，比較其吸收速度與程度是否等效，評價食物對制劑生物利用度的影響。采用三處理、三周期、三順序隨機交叉試驗，將受試者隨機分為3組，第一、二組在食用高脂飲食后服用受試制劑與參比制劑，第三組空腹服用受試制劑。給藥時，受試者至少禁食10小時，再食用高脂早餐，立即用250ml水送服受試制劑或參比制劑，空腹組一般禁食10小時以上后，早上服藥，4小時后統(tǒng)一進標準餐。6.4.2生物利用度的研究方法6.4.2.1血藥濃度法6.4.2.2尿藥數(shù)據(jù)法6.4.2.3藥理效應法6.4.3影響生物利用度的因素 生物利用度不僅受劑型因素的影響，也受生物因素的影響，6.5實例肝蘇緩釋膠囊是由單味藥趕黃草研制而成的，具有降酶、保肝、抗病毒的作用，其所含有效物質(zhì)為有機酸類和黃酮類，沒食子酸及槲皮素分別為其代表成分，動物試驗表明沒食子酸及槲皮素均有明顯的藥理活性，下面以肝蘇緩釋膠囊為例來探討中藥緩釋劑的質(zhì)量評價方法。6.5.1肝蘇緩釋膠囊的體外質(zhì)量評價6.5.1.1體外釋放度的測定溶出介質(zhì)的選擇 趕黃草中的有機酸類、黃酮類在蒸餾水和酸性介質(zhì)中的溶解度較小，達不到漏槽條件（投入藥量不得超過溶解度的10%-20%）,而在PH=7.4磷酸鹽緩沖液中能達到漏槽條件，故選擇了PH=7.4磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)。釋放度測定方法的選擇 在實驗中曾對轉籃法和漿法進行比較，用轉籃法測定釋放度的重現(xiàn)性較漿法好，又因樣品較粘，用漿法樣品易于粘杯底，攪拌效果不好，故選用轉籃法測定其釋放度。溶出條件： 轉速：100rpm 溫度：370.5 釋放介質(zhì)：經(jīng)脫氣處理的PH=7.4磷酸鹽緩沖液900ml體外釋放度中沒食酸、槲皮素的含量測定方法測定波長的選擇：將沒食子酸、槲皮素的標準品甲醇液在TU1001紫外分光光度儀上掃描測定其最大吸收波長，見圖6-1、6-2：圖6-1沒食子酸紫外吸收光譜圖 圖6-2 槲皮素紫外吸收光譜圖方法：將肝蘇緩釋膠囊投入轉籃中，分別于1、2、4、6、8、10、12小時取樣5ml(同時補加等量的溶出介質(zhì))，加乙酸乙酯萃取三次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解成10ml，在分光光度儀上于275nm、370nm處分別測定其吸光度，計算其累積釋放量。沒食子酸標準曲線的繪制 精密稱取沒食子酸對照品0.0021 g，加甲醇溶解成25ml，分別精密吸取0.5、1.5、2.5、3.5、4.5ml于5個10ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別于275nm處測定其吸光度，以濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線。表6-4 沒食子酸對照品的標準曲線數(shù)據(jù)試驗號12345濃度（mg/ml）0.0042 0.01260.0210 0.02940.0378吸光度0.0580.151 0.246 0.3610.448直線回歸方程為：Y=-0.00516+12.0958X r=0.9998，表明沒食子酸對照品濃度在0.00420.0378mg/ml中線性關系較好。沒食子酸穩(wěn)定性的考查將濃度為0.0378mg/ml的對照品溶液于不同時間測定其吸光度,計算RSD，結果見表6-5：表6-5 沒食子酸穩(wěn)定性考查結果時間(h)06122448RSD(%)吸光度0.4480.4500.4530.4510.4500.4沒食子酸標準品溶液在48小時內(nèi)吸光度RSD為0.4%,表明沒食子酸標準品在48小時內(nèi)較穩(wěn)定。精密度考查將濃度為0.0378mg/ml的沒食子酸標準品溶液在7530G分光光度計上連續(xù)測5次,計算吸光度的RSD。表6-6 沒食子酸精密度考查結果試驗號123 45RSD（%）吸光度0.4510.4490.4490.4500.4480.25從上表可知，RSD為0.25%，表明該儀器有較好的精密度。重現(xiàn)性考查沒食子酸回收率試驗:取溶出介質(zhì)5ml，分別加入3個不同濃度的沒食子酸對照品溶液1ml，加乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解成5ml，于275nm處測定其吸光度，計算回收率，結果如下：表6-7 沒食子酸回收率試驗結果試驗號加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1 0.080.0803100.42 0.080.079499.230.160.159099.499.760.740.160.1613100.850.320.316599.860.320.319799.9從上表可知，RSD為0.7%，表明本法可行。槲皮素標準曲線的繪制 精密稱取槲皮素對照品0.0024g，加甲醇溶解成25ml，分別吸取1、2、3、4、5ml于5個10ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，于370nm處測定其吸光度，以濃度X為橫坐標，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線。表6-8 槲皮素對照品的標準曲線數(shù)據(jù)試驗號 1 2345濃度（mg/ml）0.00960.01920.02880.03840.0480吸光度0.1470.282 0.4170.5490.681直線回歸方程為：Y=0.0147+13.90625X r=0.99998，表明槲皮素濃度在0.00960.048mg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。槲皮素穩(wěn)定性的考查 將濃度為0.0384mg/ml的標準品溶液于不同時間測定其吸光度,計算RSD，結果見表6-9：表6-9 槲皮素穩(wěn)定性的考查結果時間(h)06122448RSD(%)吸光度0.5480.5500.5510.5490.5450.42槲皮素標準品溶液在48小時內(nèi)吸光度RSD為0.42%,表明槲皮素標準品在48小時內(nèi)較穩(wěn)定。精密度考查 將濃度為0.0384mg/ml的槲皮素標準品溶液在7530G分光光度計上連續(xù)測5次,計算吸光度的RSD。結果見表6-10：表6-10 槲皮素的精密度考查結果試驗號1234 5RSD（%）吸光度0.5490.5480.551 0.5520.5470.38從上表可知，RSD為0.38%，表明該儀器有較好的精密度?；厥章试囼?取溶出介質(zhì)5ml,分別加入3個不同濃度的槲皮素標準品溶液1ml，加醋酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并醋酸乙酯，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解成5ml，于370nm處測定其吸光度，計算回收率，結果見表6-11：表6-11 槲皮素回收率試驗結果試驗號加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.050.049097.920.050.049398.630.100.098298.298.60.840.100.097797.750.150.149799.860.150.148699.1從上表可知，RSD為0.8%，表明本法可行。三批樣品體外釋放度測定結果表6-12 肝蘇緩釋膠囊體外釋放度測定結果6.5.1.2鑒別、檢查、含量測定方法同普通制劑相同。6.5.2肝蘇緩釋膠囊的體內(nèi)評價6.5.2.1 肝蘇緩釋膠囊在狗體內(nèi)的藥代動力學研究通過比較了肝蘇緩釋膠囊與肝蘇顆粒的體外釋放度后，表明肝蘇緩釋膠囊的釋放明顯慢于肝蘇顆粒，由于沒食子酸是肝蘇緩釋膠囊中的有效成分之一，為了考查體外釋放度的變化是否導致肝蘇緩釋膠囊體內(nèi)藥代動力學的變化，故以沒食子酸作為其中的一個特征成分，從而建立了狗服用肝蘇緩釋膠囊后血樣的處理、沒食子酸的含量測定方法，并比較了肝蘇緩釋膠囊與肝蘇顆粒在狗體內(nèi)的藥動學過程。6.5.2.1.1 HPLC方法學考查儀器與試藥 Agilent 1100型HPLC系統(tǒng)（惠普公司）；LD4-2低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；TGL-16G臺式高速離心機（上海醫(yī)用分析儀器廠）；XK96-A快速混勻器（江蘇姜堰市新康儀器廠）；肝蘇緩釋膠囊（自制，批號：001003，規(guī)格：0.28g/粒）；肝蘇膠囊(自制,批號：001003,規(guī)格:0.26g/粒)；沒食子酸對照品(中國生物制品檢定所，批號：0831-9501供含測用)血清中沒食子酸的含量測定方法 HPLC色譜分析法色譜條件：色譜柱：ODS-3柱（2504.6mm，5m）；流動相：乙腈：0.05%H3PO4(3：97)；流速：1ml/min；檢測波長：275nm；柱溫：40血清樣品處理方法的考查 分別取空白狗血清0.5ml于3個離心試管中,各加入0.2mol/L的HCl 0.25ml,快速混勻,再分別加甲醇、乙酸乙酯、丙酮至5ml，快速混勻5min，低速離心（3500r/min）10min，取上清液，供HPLC用。 圖6-7 甲醇處理的空白狗血清色譜圖 圖6 -8丙酮處理的空白狗血清色譜圖 圖6-9 乙酸乙酯處理的空白狗血清色譜圖由上圖可知，用甲醇處理的血清樣品雜質(zhì)干擾最少，故選擇用甲醇沉淀血清樣品中的蛋白為最佳。血清樣品的處理及測定空白血清樣品的制備 精密吸取空白狗血清0.5ml,加2mol/L的HCl 0.25ml,快速混勻,再加甲醇至5ml,于快速混勻器上快速混勻5min,于低速離心機(3500r/min)中離心10min,取上清液,水浴蒸干，殘渣加0.5ml甲醇溶解,高速離心(10000r/min)10min,取上清液,供HPLC用。含沒食子酸標準品血清樣品的制備 精密吸取空白狗血清0.5ml,加沒食子酸標準品適量,再加2mol/L的HCl 0.25ml,快速混勻,按空白血清樣品的處理方法制得含有沒食子酸的血清樣品,供HPLC用。 圖6-10 血清樣品色譜圖 圖6-11含沒食子酸的血清樣品色譜圖 圖6-12 沒食子酸對照品色譜圖沒食子酸在狗血清中的線性關系考查 精密吸取空白狗血清0.5ml于5個玻璃離心試管中, 加2mol/L的HCl溶液0.25ml,快速混勻,再分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml的沒食子酸(沒食子酸)標準品溶液10l,再加甲醇至5ml,于快速混勻器上混勻5min，低速離心(3500r/min)10分鐘,取上清液,沉淀再加甲醇5ml,混勻、離心，合并上清液，水浴蒸干，殘渣加1ml甲醇使溶解，高速離心（10000r/min），取上清液，分別精密吸取20l注入色譜儀,測定峰面積,以峰面積積分值Y為縱坐標,濃度X為橫坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程。表6-13 沒食子酸在血清樣品中的標準曲線濃度（ug/ml）1.05.010.020.040.0峰面積12.27681105.14036234.17118470.64050950.57912計算得回歸方程Y=-11.3310+24.07188X r=0.9999 ，表明沒食子酸的血清樣品濃度在1-40g/ml范圍內(nèi)線性關系良好。沒食子酸在血清樣品中的精密度考查 分別精密吸取含沒食子酸（20g/ml）的血清樣品20l，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，計算RSD。表6-14 沒食子酸在血清樣品的精密度考查試驗號1 23 4 5RSD（%）峰面積470.640474.231466.231475.265468.2350.86從上表可知，RSD為0.86%,表明該儀器的精密度較好。沒食子酸在血清樣品中的穩(wěn)定性考查 將濃度為10g/ml的含沒食子酸的血清樣品于不同時間測定其峰面積，計算RSD：表6-15 沒食子酸在血清樣品中的穩(wěn)定性考查時間（h）06 122448RSD（%）峰面積234.171228.142230.324232.315235.7621.9結果表明沒食子酸血清樣品在48小時內(nèi)較穩(wěn)定，RSD0.05P0.05F value (Weight 1/C)-.3589132-.8601718P valueP0.05P0.05F value (Weight 1/C/C)-7.036652E-02-.6140975P valueP0.05P0.05由表6-20可見，各室模型之間均無顯著性差異。再根據(jù)表6-18、表6-19中AIC值，按AIC最小原則，肝蘇緩釋膠囊和肝蘇普通膠囊均選擇一室模型、權重為1/C/C對個體經(jīng)時血藥濃度數(shù)據(jù)進行擬合。計算的各組藥動學參數(shù)據(jù)見表6-21：表6-21 肝蘇緩釋膠囊及普通膠囊在狗體內(nèi)的藥動學參數(shù)參AKeKat1/2(Ka)t1/2(Ke)T(peak)C(max)AUCCL/F(s)數(shù)g/ml1/h1/hhhhg/mlug/ml)*hmg/h/ug/ml緩釋組154.65200.39370.46851.47951.76082.32579.888462.74481.8759普通組2112.8010.59540.61131.13441.16471.658220.470592.34631.2772表6-22 肝蘇緩釋膠囊與普通膠囊藥動學參數(shù)據(jù)比較參數(shù)AUC（0）CmaxTmaxMRT緩釋膠囊119.691222.4555.5004普通膠囊117.651726.7933.4838成組T檢驗值0.23222.61544.3570P0.05P0.05P0.01注:t0.05,2=4.303;t0.01,2=9.925從表6-22可以看出，肝蘇緩釋膠囊與普通膠囊的Cmax與AUC無顯著性差異，而達峰時間為肝蘇普通膠囊的1.67倍，平均滯留時間(MRT)有極顯著性差異，表明肝蘇緩釋膠囊有明顯的緩釋作用，能在體內(nèi)較長時間的保持較高的血藥濃度。6.5.2.2肝蘇緩釋膠囊在狗體內(nèi)的藥效動力學研究在對趕黃草有效浸出物的藥效學篩選、有效浸出物分離精制的基礎上，通過篩選緩釋輔料，制成肝蘇緩釋膠囊，比較了肝蘇緩釋膠囊與普通膠囊的體外釋放度、肝蘇緩釋膠囊及肝蘇顆粒在狗體內(nèi)的藥代動力學，結果表明肝蘇緩釋膠囊的體外釋放明顯慢普通膠囊，肝蘇緩釋膠囊在狗體內(nèi)藥代動力學表明，肝蘇緩釋膠囊的達峰時間、體內(nèi)消除都較普通膠囊慢，為了考查肝蘇緩釋膠囊體外釋放、藥代動力學的改變是否導致了肝蘇緩釋膠囊的藥效的改變，故以SGPT為指標，測定狗給予肝蘇緩釋膠囊后不同時間體內(nèi)的SGPT含量。從而來評價肝蘇緩釋膠囊的藥效學。儀器與試藥 Beckman 700型全自動生化儀（美國Beckman公司）；LDR4-8.4C低