密度梯度離心法 density gradient centrifugation .doc

密度梯度離心法 density gradient centrifugation method， 為得到必要的濃度梯度，可采用濃氯化銫溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，預先在分離超離心機的樣品地內(nèi)制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。不連續(xù)密度蔗糖梯度離心液一般可以采用優(yōu)級純的蔗糖用超純水配制成百分比濃度分別為16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，從離心管底部逐層向上鋪設。也有用8層Feicoll梯度離心,即在14mL離心管中由下至上從84到35Feicoll液，按7遞減，各加10mL，形成7層Feicoll梯度。連續(xù)密度蔗糖梯度離心液則需要用專用儀器配制。 密度梯度離心又稱速率區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法；原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。介質(zhì)梯度應預先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶；可用來分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基及其它成分1亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機對小分子物質(zhì)溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現(xiàn)象，測定核酸或蛋白質(zhì)等的浮游密度，或根據(jù)其差別進行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜（MMeselson），斯塔爾（FWStahl），維諾格拉德（JVinograd）成功地分離了15NDNA和14NDNA以來，該法取得許多成果。為得到必要的濃度梯度，多采用濃氯化銫溶液，所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名稱，還可采用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超離心機，但在將細胞顆粒成分進行分離等以純化為目的的情況，利用密度差，使用分離超離心機，采用預先制備好的蔗糖等的密度梯度。2采用蔗糖等一些小分子溶液，預先在分離超離心機的樣品地內(nèi)制備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液后，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降系數(shù)不同的許多成分，就會出現(xiàn)許多層。這種情況采用適當?shù)木幣盘柎a，取出樣品池內(nèi)的溶液，然后進行研究。這是與1不同的一種沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分離物這點上是有優(yōu)越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦稱為蔗糖密度梯度離心法。按同樣原理，也可使用分析超離心機進行測定。 編輯本段工作原理又稱速率區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法； 原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。 介質(zhì)梯度應預先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油； 密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度注意事項離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。再通過虹吸、穿刺或切割離心管的方法將不同區(qū)帶中的顆粒分開收集，得到所需的物質(zhì)。 1、梯度介質(zhì)應具備足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍。 2、梯度介質(zhì)不會與樣品中的組分發(fā)生反應。 3、梯度介質(zhì)也不會引起樣品